Optimization of expression, purification and physicochemical properties studies of a human transcription factor ATF7

ATF7 jest czynnikiem transkrypcyjnym należącym do rodziny białek jądrowych CREB, dla którego wykazano znaczenie w procesach wzrostu i różnicowania tkanek, a także w indukcji transformacji nowotworowej. Zawiera on region zasadowy zamka leucynowego (bZIP) dzięki któremu ulega homo lub heterodimeryzacji i wpływa na transkrypcję komórkową. W celu lepszego poznania struktury tego białka uzyskano wydajną ekspresję jego ludzkiej formy zaopatrzoną w metkę histydynową na C końcu. Najwydajniejsza ekspresja uzyskana została w szczepie bakteryjnym Rosetta2 (DE3) pLysS. Białko oczyszczono z frakcji rozpuszczalnej używając chromatografii powinowactwa z zastosowaniem złoża z immobilizowanymi jonami nuklu. Ponieważ białko występowało również w osadzie, oczyszczono także ATF7 z ciał inkluzyjnych (IB). Po rozpuszczeniu preparatu w chlorowodorku guanidyny, białko poddano redukcji doprowadzając do uzyskania homogennej frakcji białkowej. Przeprowadzone testy zwijania białka, które nie pozwoliły jednak na opracowanie skutecznej metody renaturacji ATF7. W oparciu o preparat oczyszczony z frakcji rozpuszczalnej przeprowadzono badania fizykochemiczne. Wykonano pomiar denaturacji termicznej prowadzonej zarówno metodą DSF (różnicowa fluorymetria skaningowa) jak i CD (dichroizm kołowy). Oba eksperymenty wskazywały na jednoetapowy przebieg tego procesu, co potwierdza także zgodność temperatury topnienia (Tm) dla obu metod. Wykonano także pomiary własności fluorescencyjnych oparte na fluorescencji pojedynczej reszty tryptofanowej naturalnie występującej w ATF7. Wyniki wskazują na występowanie dwóch klas fluoroforów, co świadczy o tym, że białko występuje w dwóch formach konformacyjnych.

ATF7 is a transcription factor belonging to the nuclear proteins CREB family. It contains a basic region of leucine zipper domain (bZIP), through which a homo or a heterodimerisation occurs, what affects the cellural transcription. The importance of this protein in process of growth and differentiation of tissues was shown as well as its influence on an induction of carcinogenesis. In order to better understand the structure of this protein, a efficient expression of the human form, provided with a histidine tag at the C terminus of the protein was performer in the Rosetta bacterial strain. The ATF7 was purified from the soluble fraction using affinity chromatography. Since the protein also occurs in the sediment, it was also purified from inclusion bodies (IB). After dissolving in guanidine hydrochloride solution, the protein was reduced, leading to a homogenous protein fraction. A protein folding test was performed, however, it did not allow to develop an effective methods of a ATF7 renaturation. On the basis of the purified speciment from the soluble fraction, the physicochemical studies were performed. Both, DSF (differential scanning fluorimetry) and CD (circular dichroism) methods were used during a thermal denaturation experiment. Both experiments showed the one-staged denaturation process, and also allowed to calculate a thermal melting point (Tm), consistent for both methods. Additionally, based on a fluorescent properties of a single naturally occuring tryptophan residue in the ATF7, fluorescence measurements were performed. The results showed the existence of two classes of fluorophores, what indicates two conformational forms of the protein.