Identification of non - muscle myosin glycosylation sites.

Ponad połowa ludzkich białek podlega procesowi glikozylacji, zachodzącemu dzięki aktywności enzymów zaangażowanych w ten proces. Dodawane części cukrowe modyfikują funkcje glikoprotein. Wszelkie błędy zachodzące na różnych etapach tego procesu mogą skutkować specyficznymi zmianami w epitopie glikoprotein, charakterystycznymi dla wielu nowotworów (np. czerniaka). Ludzkie izoformy NM II, odgrywają istotną rolę w polaryzacji i adhezji komórek w procesie migracji komórkowej, zarówno w stanach fizjologicznych, jak i patologicznych (transformacja nowotworowa).Pionierskie badania nad profilem glikozylacji łańcuchów ciężkich niemięśniowej miozyny II A oraz II B posiadają związane z nowotworami antygeny wodorowęglanowe. Ten fakt stał się podstawą do dalszych badań, które są tematem prezentowanej przeze mnie pracy magisterskiej.W celu wyznaczenia nieznanych dotąd miejsc glikozylacji łańcucha ciężkiego ludzkiej niemięśniowej miozyny II, lizat komórkowy otrzymany z komórek czerniaka linii WM 793 poddano immunoprecypitacji z monoklonalnymi przeciwciałami anty-MYH9/10 (3H2), po czym podzielono na trzy równe części, z których dwie były następnie trawione, odpowiednio, z użyciem sjalidazy pochodzącej z Arthrobacter ureafaciens oraz mieszaniną specyficznych egzoglikozydaz. Wszystkie trzy próbki zostały poddane zarówno elektroforezie SDS - PAGE, w celu odseparowania prążka zawierającego łańcuchy ciężkie ludzkiej niemięśniowej miozyny II A i II B, jak również Western – blottingowi z przeciwciałami MYH9/10. Interesujące nas prążki zostały wycięte z żelu, a degradację białka przeprowadzono przy użyciu metody trawienia trypsyną w żelu. Otrzymane produkty trawienia trypsyną zostały poddane analizie z użyciem spektrometru mas micrOTOF-II Q, wyposażonego w źródło jonów nanoESI. Otrzymane widma były analizowane z wykorzystaniem oprogramowania Bruker Data Analysis i zinterpretowane przy użyciu narzędzia do przeszukiwania baz danych Mascot. Otrzymane sekwencje były porównywane z sekwencjami zawartymi w bazach danych Swiss-Prot oraz NCBI. Peptydy otrzymane w wyniku sekwencjonowania korespondowały, z wysokim stopniem pewności, z łańcuchami ciężkimi ludzkiej niemięśniowej miozyny II A oraz II B. Jakkolwiek metoda ta nie pozwoliła na wykrycie miejsc N – i O – glikozylacji badanych glikoprotein. W kolejnych próbach powinniśmy więc rozważyć modyfikacje procedury. Jedną z proponowanych metod jest analiza spektrometrii mas po chemicznej deglikozylacji z użyciem TFMS.

More than fifty percent of the human proteins underlies glycosylation, due to the activity of enzymes involved in this process. Added glycan moieties modify functions of glycoproteins. Any alterations at different stages of this process may result in specific glycoproteins’ epitope changes, characteristic for a number of cancers (e.g. for melanoma). Human non-muscle myosin II isoforms play an important role in cell polarity and adhesion in the process of cell’s migration, both in physiological and pathological (malignant transformation) states. Pioneering research on the non-muscle myosin heavy chain II A and II B glycosylation profiles lead to better understanding the construction of these glycoproteins important for cell activity. Unpublished results confirmed that the non-muscle myosin heavy chains II A and II B possess tumor-associated carbohydrate antigens. This fact became foundation for further research, which are the subject of the master’s thesis presented by me. To determine the unknown human non-muscle myosin heavy chain II glycosylation sites, cellular lysate derived from WM 793 melanoma cells was immunoprecipitated with anti-MYH9/10 (3H2) monoclonal antibody and then divided into three equal parts, two of which were further digested, respectively, using Arthrobacter ureafaciens sialidase or the mixture of specific exoglycosidases. All three samples were subjected to SDS-PAGE, to separate the band corresponding to human non-muscle myosin heavy chain II, as well as were Western blotted with anti-MYH9/10. The bands of interest were excised from the gel and protein degradation was performed using in-gel trypsin digestion. The obtained tryptic digests were subjected to analysis using nanoESI-micrOTOF-II Q mass spectrometer. The acquired spectra were analysed using Bruker Data Analysis software and interpreted using Mascot search engine against Swiss-Prot and NCBI sequence databases. Peptides determined by sequencing were found to correspond to a high degree of certainty to human isoforms of non-muscle myosin heavy chains II A and II B. However, this method did not allow for the detection of N - and O - glycosylation sites of tested glycoproteins. In subsequent trials we should therefore consider modifying the procedure. One of the proposed methods is mass spectrometry analysis after chemical deglycosylation with TFMS.