Application of ITS1 and ITS2 nrDNA regions sequence analysis to the identification of poisonous fungi species for diagnostics purposes.

Zatrucia grzybami wielkoowocnikowymi stanowią poważne zagrożenie dla zdrowia i życia człowieka. W ostatnich latach coraz częściej, obserwuje się także zjawisko stosowania grzybów zawierających substancje narkotyczne jako środka odurzającego. Dlatego identyfikacja gatunkowa grzybów trujących ma bardzo duże znaczenie we właściwej hospitalizacji oraz w sądownictwie. Obecnie, klasyczne i toksykologiczne metody identyfikacji gatunkowej, z uwagi na szereg ograniczeń ustępują, miejsca identyfikacji molekularnej. Wśród wielu metod identyfikacji molekularnej z powodzeniem stosuje się metodę bazującą na sekwencjonowaniu materiału genetycznego. Z uwagi na silny polimorfizm oraz na dużą liczbę powtórzeń w genomie, najczęstszymi markerami molekularnymi są niekodujące regiony ITS1 oraz ITS2, znajdujące się na jądrowym DNA. W niniejszej pracy, będącej częścią projektu badawczego „Zastosowanie analizy sekwencji regionów ITS1 i ITS2 nrDNA do identyfikacji gatunkowej grzybów trujących i halucynogennych dla celów sądowych”, realizowanego wspólnie przez Instytut Botaniki UJ oraz Instytut Ekspertyz Sądowych im. Prof. Jana Sehna w Krakowie, prowadzone były badania nad analizą i identyfikacją molekularną grzybów z próbek klinicznych (treść pokarmowa), przetworzonych chemicznie i termicznie (resztki potraw) oraz z suszu grzybowego. Podjęto także próbę stworzenie bazy danych referencyjnych sekwencji pochodzących z owocników trujących, w tym halucynogennych, a także pospolitych gatunków grzybów jadalnych wstępujących na terenie Polski. DNA z materiału grzybowego izolowano metodą magnetyczną, amplifikowano a następnie sekwencjonowano. W przypadku materiału referencyjnego sekwencjonowaniu poddano regiony ITS1 i ITS2 nrDNA, materiał kliniczny identyfikowano w oparciu o porównianie sekwencji regionu ITS2 z sekwencjami dostępnymi w bazie GenBank oraz własnej bazy referencyjnej. Ze 149 próbek klinicznych 78 zidentyfikowano do gatunku. Spośród 152 analizowanych próbek referencyjnych uzyskano 138 sekwencji regionu ITS1 oraz 135 sekwencji regionu ITS2, należących do 112 gatunków należących do 48 rodzajów. Zastosowana metoda identyfikacji materiału klinicznego okazała się być w dużym stopniu skuteczna. Ograniczeniem metody jest przede wszystkim brak możliwości analizy mieszanin oraz czasochłonność, stąd może ona być stosowana przede wszystkim w przypadkach sądowych.

Macrofungi poisonings are a serious threat to people’s health and life. Nowadays increasing trend to use mushrooms containing narcotic substances as intoxicants, can also be observed. For this reason the identification of poisonous fungi plays a great role in the correct hospitalization and in judiciary. At present, due to a series of restrictions, classical and toxicological methods of the species identification give way to molecular identification. Among many methods of molecular identification the one based on sequencing of the genetic material is successfully used. Because of the strong polymorphism and a great number of repetitions, the most common molecular markers are the non-coding regions ITS1 and ITS2, located on the nuclear DNA. This thesis, being a part of the research project “Application of the ITS1 and ITS2 nrDNA regions sequence analysis to the identification of poisonous and hallucinogenic fungal species for judicial purposes”, implemented by the Jagiellonian University Instutite of Botany and the Institute of Forensic Research in Kraków, the research has been made on the molecular analysis and identification of fungi from clinical samples (ingested fungi), chemically and termally processed samples (food) and forensic material (dried sporocarps). An attenpt was also made to construct a reference database of DNA sequences of poisonous, including the hallucinogenic fungi, as well as common edible mushroom species from the territory of Poland. Fungal DNA was isolated using magnetic method, amplified and sequenced. In case of reference material, ITS1 and ITS2 nrDNA regiones were sequenced, clinical material identification was based on ITS2 sequences by comparison with sequences present in GenBank (NCBI) database, and sequences from constructed reference database. In total, 78 species out of 149 analysed, were identified from clinical, processed and forensic samples. Out of 152 reference samples analysed, 138 ITS1 and 135 ITS2 sequences were obtained, which belong to 112 species from 48 genera. The method used in identification of clinical and forensic material turned out to be effective. The method is, however, time-consuming, and it is not effective in case of DNA mixtures, which is its main limitation.