Flow cytometric identification of plasma membrane microparticles in sera of patients with colorectal cancer

Mikropęcherzyki (MV, ang. microvescicles) to niewielkich rozmiarów, najczęściej kuliste twory uwalniane przez prawie wszystkie komórki organizmu zarówno konstytutywnie, w trakcie wzrostu komórek, jak również w warunkach aktywacji oraz apoptozy. Tworzą one heterogenną- zarówno pod względem rozmiarów jak i budowy- populację pęcherzyków. Mogą być wydzielane przez oderwanie z błony komórkowej, wówczas nazywane są mikrofragmentami błonowymi lub ektosomami. Innym rodzajem mikropęcherzyków są egzosomy, wydzielane z wewnątrz komórkowych kompartmentów na drodze egzocytozy. Mikropęcherzykom oprócz ich roli fizjologicznej, przypisuje się również znaczenie w patologii wielu chorób, takich jak: nowotwory, stany zapalne, choroby układu sercowo- naczyniowego (miażdżyca, zespół wykrzepiania wewnątrznaczyniowego) czy choroby autoimmunizacyjne. Uważa się, iż mikrofragmenty komórek nowotworowych (TMV) mają duże znaczenie zarówno dla procesu wzrostu guza, jak i dla tworzenia przerzutów. TMV na swojej powierzchni posiadają specyficzne markery komórek nowotworowych,co potencjalnie umożliwia ich wykorzystanie w diagnostyce chorób nowotworowych oraz monitorowaniu stanu klinicznego pacjenta.W pracy metodą cytometrii przepływowej oceniano immunofenotyop mikrofragmentów błonowych (MP) krążących we krwi chorych na raka jelita grubego. Do oznaczeń użyto próbek indywidualnych osoczy pochodzących od 6 pacjentów oraz osoczy spulowanych od 11 chorych. Oznaczenia w pulach osoczy pochodzących od pacjentów porównano z wynikami w pulach osoczy pochodzących od 8 zdrowych dawców. Poziomy ekspresji poszczególnych antygenów charakterystycznych dla raka jelita grubego u pacjentów wykazywały spore zróżnicowanie osobnicze. W pulach osoczy pochodzących od pacjentów wykazano wyższe poziomy antygenu HER2/neu niż w pulach pochodzących od zdrowych dawców. Wykonano również oznaczenia markerów płytkowych w próbkach pochodzących od 3 zdrowych dawców, pobranych na jeden z dwóch antykoagulantów- EDTA lub roztwór cytrynianu sodu. Próbki te wirowano sekwencyjnie. Wykazano wpływ EDTA na wynik oznaczeń antygenu CD41a, którego obecność na MP była niższa niż w próbkach pobranych do probówek zawierających cytrynian sodu.

Microvesicles (MV) are small, mostly spherical particles released by almost all body cells, both constitutively during growth of cells, as well as in the conditions of activation and apoptosis. They form a heterogeneous in size and content population of vesicles. These particles may be formed by deatachment from the cell membrane; they are called membrane microparticles or ectosomes. Another type of micro-bubbles is egzosomes, secreted from intracellular compartments by exocytosis. Besides physiological importance of microvesicles, they have an important role in the pathology of many diseases such as cancer, inflammatory diseases, cardiovascular diseases (atherosclerosis, disseminated intravascular coagulation), or autoimmune diseases. It is considered that tumor cells microvesicles (TMV) are particularly important for the process of tumor growth and for metastasis. TMV carry specific markers of cancer cells on its surface, which could potentially allow their use in the diagnosis of cancer and monitoring the patient's clinical state.In this study, immunophenotype of microparticles (MP) circulating in blood of patients with colorectal was assessed by use of flow cytometry. Individual samples of serum from the 6 patients and pooled sera from 11 patients were used. Results from pools from patients were compared with pools of sera derived from 8 donors. The levels of expression of antigens specific for colorectal cancer patients showed considerable interindividual variation. The pools of sera obtained from patients demonstrated higher levels of the HER2/neu antigen than obtained in pools derived from healthy donors. In addition, platelet markers were identified in the samples of sera from three healthy donors which were collected in two anticoagulants - EDTA and solution of sodium citrate. These samples were centrifuged sequentially. EDTA has been shown to influence the outcome of the CD41 antigen, the presence of the MP that is lower in the samples into tubes containing sodium citrate.