Equilibrium Unfolding Characterization of the Brain-Specific Heme-protein: Neuroglobin

Neuroglobina (Ngb) to monomeryczne białko hemowe znajdujące się w mózgu, posiadające ogromną wnękę w strukturze (~300 Å3) w miejscu wiązania liganda do pierścienia porfirynowego. Jej właściwości umożliwiają prowadzenie badań przy pomocy różnych technik na kilku poziomach organizacji strukturalnej oraz możliwa jest charakteryzacja procesu fałdowania poprzez pomiary: absorbancji dla pasma Soreta przy 413 nm (hem), eliptyczność przy 222 nm za pomocą dichroizmu kołowego (struktura drugorzędowa) oraz maksimum emisji fluorescencji reszt tryptofanowych dla 340 nm (struktura trzeciorzędowa). Uzyskane wyniki dla Ngb typu dzikiego (WT) zostały porównane z mutantami tego białka: F106W i M144W, uzyskanymi przez substytucje odpowiednio w helisie G i H oraz z innymi białkami hemowymi: bakteryjną cyjanoglobiną (GlbN) i mioglobiną (Mb) z różnych gatunków kręgowców na podstawie danych dostępnych w literaturze. Energia swobodna Gibbsa holo-Ngb WT osiągnęła wartość 9.9 ± 0.1 kcal/mol dla obu eksperymentów dichroizmu kołowego i fluorescencji równowagowej denaturacji indukowanej obecnością chlorowodorku guanidyny. W przypadku formy apo-Ngb WT zachodzi trzy-stanowy proces fałdowania i stan pośredni został zaobserwowany. Dzięki posiadaniu wielkiej wnęki w strukturze, grupy prostetycznej, która wygasza sygnał fluorescencji tryptofanu oraz przeprowadzaniu więcej niż dwu-stanowego procesu fałdowania, neuroglobina jawi się jako interesujący obiekt badań z użyciem wysokiego ciśnienia.

Neuroglobin (Ngb) is a monomeric heme-protein expressed in brain, which contains a large internal cavity (~300 Å3) in the ligand-binding pocket. Its properties enable to perform studies using different techniques at various levels of structure organization. In this work folding parameters were measured by monitoring three signals: absorbance for Soret band at 413 nm connected with heme group, circular dichroism ellipticity at 222 nm describing secondary structure and maximum of fluorescence emission maximum of Trp residues at 340 nm related to tertiary structure. The results obtained for Ngb WT were compared with two variants of this protein with reduced cavity volumes: F106W and M144W mutants and also with different heme-proteins: bacterial cyanoglobin (GlbN) and myoglobin (Mb) from four vertebrate species, based on literature reports. The Gibbs energy of stability of holo-Ngb WT reached high value: 9.9 ± 0.1 kcal/mol from both CD and fluorescence GdmCl-induced unfolding measurements. In the case of apo-Ngb WT three-state unfolding process occurred with clearly observed intermediate state. Due to the large cavity in structure, to the presence of its prosthetic group that quenches fluorescence signal of Trp and providing a multiple-state unfolding process, Ngb appears to be an interesting biological object for high-pressure study.