The effect of applied direct current electric fields (dcEF) on the migratory strategy - dependent directional migration of Walker 256 rat carcinosarcoma cells.

Zjawisko powstawania endogennego pola elektrycznego (eEF) związanego z ak-tywnością różnych tkanek tj. mięśnie, tkanka nerwowa oraz w trakcie procesu gojenia się ran, znane jest już od wielu lat. Wraz z rozwojem zaawansowanych technik pomia-rowych i badawczych możliwe było wnikliwe zbadanie oddziaływania eEF na komórki. Wiele typów komórek prawidłowych i nowotworowych np. komórki endotelialne, fi-broblasty, mezenchymalne komórki macierzyste szpiku ludzkiego, komórki raka piersi lub płuc, reaguje kierunkową migracją w polu elektrycznym. Zjawisko to nazwane zo-stało elektrotaksją lub galwanotaksją. Kierunkowa migracja komórek ma duże znaczenie w procesach fizjologicznych oraz patologicznych do których należą: proces gojenia się ran, reakcja odpornościowa organizmu, rozwój embrionalny i tworzenie przerzutów przez komórki nowotworowe o charakterze metastatycznym. Różne strategie migracji komórek są wypadkową wielu czynników m.in oddziaływań ze środowiskiem w jakim się znajdują, ich pochodzenia oraz pełnionej funkcji. Mechanizm kierunkowej migracji nie został do końca wyjaśniony. Rozpatruje się wiele czynników mogących pośrednio lub bezpośrednio wpływać na kierunkową migrację komórek. Zaliczane są do nich m.in wewnątrzkomórkowe jony Ca2+, reorganizacja cytoszkieletu mikrotubularnego (MT), depolaryzacja i hyperpolary-zacja błon komórkowych oraz organelli wewnątrzkomórkowych, aktywacja ścieżek sygnalizacyjnych z udziałem białek z rodziny Rho, cAMP, kinaz MAP oraz ROCK. W niniejszej pracy zbadano wpływ pola elektrycznego na migrację dwóch subli-nii komórek mięsakoraka Walkera 256. Pierwsza Sublinia charakteryzowała się silną adhezją do podłoża oraz migracją o charakterze mezenchymalnym, natomiast komórki drugiej sublinii były słabiej zaadherowane i poruszały się przy użyciu spontanicznie wytwarzanych pęcherzykowatych wypustek.Zaobserwowano, że w polu elektrycznym o natężeniu 0 – 3 V/cm komórki obu sublinii poruszają się w stronę katody a ich kierunkowa reakcja zależna jest od jego natężenia. Następnie wykazano, że rozbicie MT, pod wpływem 1 µM kolchicyny, w komórkach sublinii adherentnej spowodowało zmniejszenie kierunkowości migracji w polu elektrycznym o natężeniu 3 V/cm oraz zainicjowało wytwarzanie pęcherzyko-watych wypustek. Analiza architektury cytoszkieletu mikrotubularnego tych komórek wykazała brak zależności pomiędzy kierunkową migracja a spolaryzowanym ułożeniem włókien mi-krotubul, co sugeruje, że mikrotubule nie są istotnym czynnikiem w kierunkowej mi-gracji komórek WC 256 w EF. Zaobserwowano również, że dodanie do komórek sub-linii adherentnej WC256 1 µM kolchicyny razem z 10 µM Y-27632 inhibitorem kinazy ROCK zahamowało wytwarzanie pęcherzykowatych wypustek oraz częściowo przy-wróciło kierunkowość migracji. Komórki po inkubacji z samym Y-27632 charaktery-zowały się wydłużonym kształtem. Analiza aktywności ruchowej komórek sublinii słabo adherentnej WC 256 w obecności 1 µM kolchicyny wykazały jej hamujący wpływ na kierunkowość migracji w polu elektrycznym o natężeniu 3 V/cm, co sugeruje że wytwarzanie pęcherzyków nie ma decydującego udziału w kierunkowej migracji. Otrzymane wyniki świadczą o braku udziału w kierunkowej migracji komórek WC 256 zarówno spolaryzowanych mikrotubul jak i pęcherzykowatych wypustek. Efekt zahamowania kierunkowej migracji komórek WC 256 w polu elektrycz-nym, w wyniku potraktowania kolchicyną, może zachodzić poprzez wpływ tego związ-ku na inne procesy. Nie można wykluczyć udziału kolchicyny w regulacji takich proce-sów jak płynność i integralność błon, adhezję komórek do podłoża lub kanały jonowe, skutkujące dezorganizacją funkcji komórki.

Many types of cells, including normal and cancer cells, migrate directionally in direct current electric field (dcEF). This phenomenon is called electrotaxis or galvanotaxis if cells migrate to the cathode. Directional cell migration is important in many physiological and pathological processes, which include: the process of wound healing, the body's immune responses, embryonic development and metastasis for-mation. Probably many factors participate in the mechanism of directional migration. Examples include the intracellular Ca2+ ions, the reorganization of microtubules cyto-skeleton and hyper-polarization and depolarization of cell membranes or organelles, activation of signaling pathways involving the Rho family protein, cAMP, MAP kinase, and ROCK. In the present study the effect of electric field on migration of two cells sublines carcinosarcoma Walker 256 was investigated. The first (subline 2) is characterized by strong adhesion to the substrate and less efficient locomotion, while the second (subline 3) was less adherent and migrates in non-adhesive mode using spontaneously generated blebs. Cells exposed to the electric current field between of 0 - 3 V/cm showed elctrotaxis toward the cathode and the directional response depended on the current intensity. Furthermore, colchicines-stimulated depolymerization of MTs reduced the directionality of migration in the electric field (3V/cm), and initiated the production of membrane blebs. Analysis of microtubules cytoskeleton architecture during direc-tional migration showed that there is no relationship between the direction of migration and polarization of MTs. Preincubation of the adhesive subline Walker 256 cells in the presence of 1 µM colchicine together with 10 µM Y-27632 inhibited the production of blebs and partially restored the directionality of migration. Moreover, it was found that the addition of 1 µM colchicine reduces directional migration in the electric field inten-sity of 3 V / cm in less adherent subline WC 256, which suggests that the production of blebs doesn’t affect the direction of migration. In summary, the results suggest that microtubule polarity and the production of blebs are not determining factors in the regulation of directional migration of WC 256 in the direct currents electric fields. The inhibitory effect of colchicines on the electrotaxis of WC 256 cell may be mediated by different mechanism. We cannot exclude the direct effect of colchicines on membrane structure or its integrity, adhesion, ion channels, resulting in the disorganisation of function.