Uzyskanie nowej linii Drosophila melanogaster charakteryzujacej sie brakiem produkcji dopaminy w centralnym układzie nerwowym za pomoca niebinarnego systemu ekspresji

Tyrozynaza Hydroksylowa produkowana przez Drosophila melanogaster (DTH – Drosophila Tyrosine Hydroxylase, kodowana przez gen ple), enzym limitujacy biosyntezę dopaminy posiada dwie tkankowo-specyficzne izoformy transkrypcyjne; ekspresjonowną w centralnym układzie nerwowym (CNS – central nervous system) oraz w hipodermie. Riemensperger et. at., 2010 używając zmodyfikowanego transgenu DTH przywrócił ekspresję hipodermalnej izoformy DTH u mutanta ple2. Muchy otrzymane za pomocą tej metody nie ekspresjonują dopaminy w CNS oraz wykazują szereg defektów behawioralnych wskazujących na istotną rolę dopaminy [1,2]. Binarny system ekspresji Gal4/UAS użyty do otrzymania tego genotypu utrudnia ekspresojnowanie kolejnych transgenów na jego tle.Poniższa praca magisterska prezentuje otrzymanie nowej linii Drosophila melanogaster z wyłączoną ekspresją DTH w CNS bez użycia binarnego systemu ekspresji. Dwie mutacje punktowe zmieniające ramkę odczytu (FS – Frameshift mutations) zostały wprowadzone za pomocą rekombinacji homologicznej u bakterii do genomowej sekwencji plazmidu BAC o długości 20kb, obejmującej gen ple. 20kb DTH BAC, jak również 20kb DTH FS BAC zostały specyficznie zintegrowane z trzecim chromosomem, a następnie zrekombinowane z chromosomem ple2. Oba transgeny zniosły letalny fenotyp ple2. 20kb DTH BAC przywrócił ekspresję DTH w CNS do poziomu porównywalengo z dzikim typem, podczas gdy 20kb DTH FS BAC nie był ekspresjonowany w CNS. Analiza immunohistochemiczna wykazała normalny układ neuronów DTH-pozytywnych u much ekspresjonujących 20kb DTH BAC. Mózgi wyizolowane z much ekspresjonoującyh 20kb DTH FS BAC nie prezentują żadnych neuronów DTH-pozytywnych.Eksperymenty bahawioralne wskazują na zmniejszoną rytmiczność okołodobową, oraz zaburzoną odpowiedź na przesunięcia cyklu dnia i nocy u much z przywróconą ekspresją DTH za pomocą 20kb DTH BAC. Brak rytmiczności behawioralnej spowodowany jest najprawdopodobniej nieletalnymi mutacjami punktowymi, które zostały wprowadzone wraz z allelem ple2, ponieważ po kilkukrotnej rekombinacji z dzikim typem nastąpiła znaczącą poprawa rytmiczności. Krzyżówki z dzikim typem są kontynuowane w celu przywrócenia czystego tła genetycznego. Muchy pozbawione ekspresji dopaminy w CNS są wykorzystywane jako tło genetyczne do jej przywracania w specyficznych neuronach za pomocą systemu Gal4/UAS. Eksperymenty behawioralne przeprowadzone dzięki temu genotypowi mogą dostarczyć cennych informacji dotyczących dopaminergicznej regulacji cyklu okołodobowego.

Drosophila tyrosine hydroxylase (DTH, encoded by ple), is the rate-limiting enzyme in dopamine biosynthesis, expresses in the CNS and hypoderm, with tissue-specific alternatively spliced isoforms. It was shown by Riemensperger et al, 2010, that a modified DTH gene that is selectively expressed in the hypoderm but not in the CNS rescues the lethality of a DTH null mutation (ple2), generating healthy flies with minor deficiencies. These flies have undetectable brain dopamine, and show a number of behavioral defects that elucidate novel roles for neural dopamine [1,2]. These flies however rely on the Gal4/UAS binary expression system, making further genetic manipulations difficult. Here I present an approach that removes DTH expression from the CNS without the use of binary expression tools. The hypoderm-selective frameshift (FS) mutations were recombineered into a 20kb genomic BAC clone, which has been integrated site-specifically into a 3rd chromosome, and then recombined with a ple2 mutant chromosome. Both 20kb DTH BAC and 20kb DTH FS BAC rescue ple2 lethality. 20kb DTH BAC rescues the CNS-specific DTH 1 isoform to normal level comparable to that which is measured in a wild type strain, while 20kb DTH FS BAC does not. 20kb DTH BAC also rescues the spatial pattern of DTH expression in the brain, while rescue by 20kb DTH FS BAC does not result in any DTH-positive neurons in the brain.The results of behavioral experiments performed on 20kb DTH BAC rescue flies indicated reduced circadian rhythmicity and inability to photoentrain to dim levels of light. After outcrossing the 20kb DTH BAC rescue strain several times to an isogenic wild type background, preliminary experiments show significant improvement in circadian rhythmicity, suggesting that the arrhythmicity may have been caused by non-lethal mutations present on the ple2 chromosome. Outcrossing will be continued in order to provide a cleaner genetic background. Ongoing behavioral experiments on the 20kb DTH FS BAC flies in which DTH expression has been restored in specific subsets of neurons will hopefully shed new light on the role of dopamine in Drosophila circadian behavior.