Development of phage display-based synthetic antibodies for epigenetic research

Development of phage display-based synthetic antibodies for epigenetic research

Moja praca skupia się na tworzeniu syntetycznych przeciwciał używanych do charakteryzacji białek kluczowych dla regulacji procesów epigenetycznych, ze szczególnym uwzględnieniem rodziny enzymów z grupy demetylaz histonów. Obecenie komercyjnie dostępne przeciwciała nie spełniają wysokich wymogów, jakie stawiają im zaawansowane technologie takie jak immunoprecypitacja chromatyny sprzęgnięta z sekwencjonowaniem. W tym celu posłużono się technologią prezentacji na fagu, która jest doskonałym źródłem odnawialnych syntetycznych fragmentów przeciwciał (sAB) skierowanych przeciwko wyżej wymienionym enzymom. Metylacja histonów pełni kluczową role w regulacji transkrypcji, przez co uczestniczy w niezliczonej ilości procesów biologicznych. Poprzez otrzymanie przeciwciał specyficznych dla enzymów metylujacych i demetylujacych histony, umożliwi pogłębienie wiedzy na temat struktury i funkcji tych białek w komórkach ssaczych. W przedstawionej pracy opisane zostały eksperymenty, które pozwoliły na otrzymanie i opisanie właściwości i zastosowań syntetycznych fragmentów przeciwciał skierowanych przeciw enzymom zaangażowanym w regulacje epigenetyczną. Olbrzymia różnorodność właściwości wiązania antygenów i łatwość uzyskania przeciwciał sAB umożliwiła nam porównanie z obecnie powszechnie używanymi przeciwciałami monoklonalnymi i poliklonalnymi. Aby osiągnąć ten cel otrzymaliśmy duży zbiór specyficznych syntetycznych fragmentów przeciwciał, z pośród których wybraliśmy przeciwciała rozpoznające zarówno natywne, zdenaturowane oraz chemicznie zmodyfikowane formy białka. Syntetyczne przeciwciała mogą być z powodzeniem wykorzystywane w takich technikach laboratoryjnych jak western blot, eksperymenty oparte na immunoprecypitacji oraz inne metody oparte na wykrywaniu przeciwciał. Przeciwciała sAB posiadają dużą przewagę ekonomiczną i technologiczną nad obecnie używanymi przeciwciałami poliklonalnymi oraz monoklonalnymi i z pewnością pozwolą na szczegółową analizę zarówno procesów biologicznych jak i właściwości enzymów zaangażowanych w regulacje epigenetyczną.

My research focuses on developing synthetic antibodies for functional characterization of key epigenetic regulators, with a particular focus on the histone demethylase (KDM) enzyme family. Currently commercially available antibodies lack reproducibility and specificity required by modern epigenetic assays such as chromatin-immunoprecipitation combined with sequencing (ChIP-Seq). Phage display technology applied to this area of research provides a powerful approach for generation of inexhaustible source of novel synthetic affinity binders (sABs) to these important enzyme targets.Histone methylation is a crucial element of transcription regulation and therefore plays important roles in many biological pathways. By developing sABs that target specific HMTs and KDMs, we hope to advance structural characterization and better understanding of the function of these proteins in mammalian cells. In this work I present experiments that allowed me to generate and characterize properties and the utility of the sABs selected against several enzymes involved in epigenetic regulation. Simplicity in generation of sABs with vast diversity in binding characteristics provides the opportunity to compare the utility of sABs with traditional antibodies. To achieve this goal I have produced a large array of specific binders from which found sABs that recognize native, denatured and the chemically modified state of proteins to be used in many laboratory techniques such as western blot and immunoprecipitation experiments, as well as any method relying on antibody detection. Such tools and reagents will have huge economical and technological advantage over commonly used polyclonal and monoclonal antibodies and offer new ways forward to study the complexities of epigenetic regulation of biological processes in a general way.