A transcriptome investigations by using next-generation sequencing methods.

Streszczenie:Transkryptom to zestaw wszystkich rodzajów RNA obecnych w komórce. Najważniejsząfrakcją komórkowego RNA jest mRNA, które jest produktem transkrypcji i służy jakomatryca w procesie translacji. Transkryptomika to dziedzina nauki wykorzystującatranskryptomy do badań naukowych nad ekspresją genów w komórce. Jest kilka metodbadania transkryptomów, jednak najbardziej popularnym sposobem ich analizy jestsekwencjonowanie. Ponieważ używane obecnie metody służą do sekwencjonowania DNA,aby możliwe było odczytanie sekwencji mRNA niezbędne jest przepisanie go na cDNA wprocesie odwrotnej transkrypcji. Historycznie pierwszą metodą było sangerowskiesekwencjonowanie metodą terminacji łańcucha, która wciąż wykorzystywana jest wlaboratoriach. Obecnie dostępne są też nowoczesne metody sekwencjonowaniawielkoskalowego. Najczęściej wykorzystywane są: pirosekwencjonowanie 454 (Roche),SOLiD (Applied Biosystems) i Solexa (Illumina). Badana sekwencja jest odczytywana przezaparaturę w trakcie przeprowadzania specyficznych dla każdej z platform reakcjichemicznych. Produktem sekwencjonowania jest pula odczytów (o długości 35 – 700 pz wzależności od stosowanej metody). Te odczyty muszą zostać odpowiednio złożone, abymożna było rozszyfrować sekwencję badanego transkryptomu. Składanie przeprowadzane jestprzez specjalne programy oparte na specyficznych algorytmach. Zestaw odczytów składanyjest w kontigi, a zespół kontigów przedstawia badaną sekwencję. Metoda oparta nasekwencjonowaniu wielkoskalowym i assembler-ach to tak zwane RNA-Seq, obecniewykorzystywane w genetyce, transkryptomice i w innych dziedzinach nauki do badaniaekspresji genów w komórce.

Abstract:A transcriptome is a set of whole RNA present in a living cell or in a group of cells. Themost important fraction of the cell’s RNA is mRNA, which is a product of transcription and isused as a template in translation. Transcriptomics is the field of genetics which usestranscriptomes to investigate gene expression. Sequencing methods are the key techniquesused in such studies, allowing the discovery of amino-acid sequences of mRNA moleculespresent in the cells or tissues. Since mRNA molecules are highly unstable, the first phase oftranscriptome seqencing usually is the synthesis of cDNA (DNA complementary to mRNA)in the process of reverse transcription. cDNA is then sequenced in the same way as normalDNA. Sanger’s method of chain termination sequencing was the first one and is still used inlaboratories worldwide. Currently, much more efficient next-generation sequencing methodsare available. The most frequently used are: 454 pyrosequencing (Roche), SOLiD (AppliedBiosystems) and Solexa (Illumina). The sequence of interest is analyzed by specializedcomputers during specific chemical reaction, which are run in sequencing machines. Theresult of the sequencing are reads of the length depending on the method used (35 – 700 bp).This set of reads has to be assembled into the consensus sequences representing mostprobable sequences of longer DNA molecules. Special programs based on specific algorithmsare used for this purpose. A set of reads is assembled into contigs and the set of contigs givesthe sequence of interests. The approach based on next-generation sequencing and usingassemblers for data analysis is called RNA-Seq. It has become a method of choice forgenetics, transcriptomics and the other sciences investigating gene expression.