Influence of metal contamination and isolation on metallothionein gene expression in bank vole Myodes glareolus

Celem badań był pomiar poziomu ekspresji genu metalotioneiny 1 (MT–1) w tkankach wątroby nornicy rudej Myodes glareolus w zależności od poziomu akumulacji metali ciężkich (Cd, Pb) oraz stopnia izolacji badanych populacji. W tym celu wybrano populacje z terenów zanieczyszczonych metalami, położonych na Górnym Śląsku (Katowice, Miasteczko Śląskie, Olkusz) oraz populacje z terenów czystych (Niepołomice, Mikołajki, Teleśnica Oszwarowa). Do badań zostały włączone populacje izolowane, pochodzące z wysp na jeziorach Pojezierza Mazurskiego (J.Dobskie, J.Dejguny) i z Bieszczad (Wyspa Skalista), by dodatkowo sprawdzić wpływ izolacji na poziom ekspresji MT–1.Nornice rude były odławiane przy pomocy pułapek żywołownych, od lipca do października 2009 r. Złapane zwierzęta, w liczbie 117, po przywiezieniu do laboratorium były zabijane metodą dekapitacji, po czym pobierano wątrobę do dalszych analiz. Fragment wątroby przeznaczony do analiz molekularnych wcześniej zatopiono w buforze stabilizującym RNAlater (Qiagen). Pobrane próby wątroby przetrzymywano w zamrażarce w temperaturze –70°C. Poziom metali został zmierzony przy pomocy spektrofotometru absorpcji atomowej (AAS AANALYST 800, Perkin Elmer), po wcześniejszej mineralizacji tkanek.Stężenia ołowiu w tkankach wątroby nornicy rudej wahały się w zakresie od 0,18 do 0,77 mg/kg s.m. Statystycznie istotne różnice stwierdzono tylko między poziomami ołowiu w wątrobach nornic z populacji z Olkusza a populacjami z Mikołajek i J.Dobskiego. Stężenie kadmu przedstawiało się na bardziej zróżnicowanym poziomie (zakres 0,23–10,43 mg/kg s.m.). Jednoczynnikowa analiza wariancji wykazała istotnie wyższe stężenie zarówno ołowiu, jak i kadmu, u zwierząt z terenów zanieczyszczonych, w porównaniu do zwierząt z innych badanych terenów. Pomiędzy populacjami lądowymi i wyspowymi nie stwierdzono różnic, także płeć zwierząt nie miała istotnego wpływu na akumulację metali w tkankach wątroby.Pomiar ekspresji genu MT–1 dokonano metodą reakcji PCR w czasie rzeczywistym (Real–Time PCR). Jako gen referencyjny wybrano gen 18s. Względną ekspresję genu MT–1 dla poszczególnych populacji, obliczono względem ekspresji MT–1 w wątrobach zwierząt z populacji Mikołajki, posługując się metodą delta delta CT.Ekspresja genu MT–1 osiągnęła najwyższy poziom w populacjach z trenów zanieczyszczonych, u których stwierdzono również istotnie wyższy poziom ołowiu i kadmu w wątrobach – w populacji z Miasteczka Śląskiego (7,5–krotny wzrost ekspresji), Olkusza (6,2–krotny wzrost) i Katowic (4,7–krotny wzrost). Ekspresja genu MT–1 wykazała dodatnią korelację ze stężeniem kadmu w tkankach wątroby (r2 = 0,5167; r = 0,7189; p = 0,0291). Związek między ekspresją a stężeniem ołowiu w wątrobach nornicy rudej nie został wykazany na poziomie istotnym statystycznie (r2 = 0,4309; r = 0,6565; p = 0,0548). Analiza zależności między wartością delta CT a poziomem metali w tkankach wątroby wykazała ujemną korelację w przypadku kadmu (r = –0,25; p = 0,0064). Ołów nie miał istotnego wpływu na wartość delta CT.

The objective of this thesis was to examine the state of metallothionein gene’s (MT–1) expression in tissues of the bank vole’s liver. The study was determined by the concentration of heavy metals (Cd, Pb) in liver of bank voles and isolation degree in population of these rodents. The populations that were chosen for the research are: from metal–contaminated sites in Górny Śląsk (Katowice, Miasteczko Śląskie, Olkusz), from uncontaminated sites (Niepołomice, Mikołajki, Teleśnica Oszwarowa) and isolated sites – islands on lakes in Pojezierze Mazurskie and in Bieszczady (Dobskie L., Dejguny L., Skalista).Bank voles were captured using live traps in the period from July to September 2009. 117 bank voles were collected and transported to the laboratory and then killed by decapitation. The liver samples were dissected from each animal and kept frozen at –70°C. The tissues’ samples that were used for molecular analyses were kept in RNAlater buffer. The liver samples were mineralized in nitric acid and then the concentration of Cd and Pb in each sample was measured by atomic absorption spectophotometry (AAS AANALYST 800, Perkin Elmer).The concentration of Pb in the tissues of bank voles ranged from 0,18 to 0,77 mg/kg d.w. Statistical analyses showed significant difference between lead levels in liver of animals from Olkusz, and from Mikołajki and Dobskie Lake. The concentration of Cd showed more variety – ranged from 0,23 to 10,43 mg/kg d.w. The analysis of variance proved a significant higher concentration of Pb and Cd in the animal population from contaminated sites than from the sites that were not contaminated. There was no significant difference between animals from the islands and main land, also the sex of animals did not influence Pb and Cd accumulation in their liver. The expression of MT–1 gene was measured using the quantitative Real–Time PCR method. 18s gene was chosen as a reference gene. Relative MT–1 expression for each population was calculated according to MT–1 expression in bank voles’ livers from Mikołajki. The method that was used was delta delta CT.The level of MT–1 gene expression was the highest in livers of bank voles from contaminated sites – in animals from population from Miasteczko Śląskie 7,5–fold higher than those from Mikołajki; in Olkusz 6,2–fold, and Katowice 4,7–fold. The MT –1 expression was positively correlated with cadmium concentration in liver’s tissues (r2 = 0,5167; r = 0,7189; p = 0,0291). The correlation between MT–1 expression and lead concentration was statistically insignificant (r2 = 0,4309; r = 0,6565; p = 0,0548). Statistical analysis showed that delta CT value was negatively correlated with the concentration of cadmium in bank voles’ livers (r = –0,25; p = 0,0064). Lead did not influence on delta CT value.