Obtaining Halo-5-HT2C and SNAP-5-HT2C genetic constructs of serotonin receptor in order to study dimerization of this receptor by HTRF technique

Receptor 5-HT2C, należący do rodziny receptorów sprzężonych z białkami G (GPCR, ang. G Protein-Coupled Receptor), jest jednym z miejsc wiązania serotoniny w ludzkim systemie nerwowym. Heteromeryzacja receptorów 5-HT2C bezpośrednio powoduję zmianę powinowactwa względem ligandów, modyfikację w przekazie sygnału oraz może być istotnym czynnikiem w rozwoju chorób neuropsychiatrycznych. Z tego powodu badanie heteromeryzacji 5-HT2C jest przedmiotem zainteresowań wielu projektów badawczych. Technika HTRF (ang. Homogenous Time Resolved Fluorescence) wykorzystuje zjawisko FRET (ang. Fluorescence Resonance Energy Transfer) w połączeniu z rozdzielczymi w czasie pomiarami fluorescencji z jednoczesną eliminacją sygnału pochodzącego z tła. Jest to możliwe ponieważ w tej technice, jako donora energii używa się jony lantanowca - europu lub terbu, otoczonego pierścieniami heterocyklicznymi - taka struktura, zwana kryptatem, charakteryzuje się emisją fluorescencji o długim czasie życia, którą można rejestrować z opóźnieniem, w czasie którego dochodzi do wygaszenia autofluorescencji oraz fluorescencji medium. Technika HTRF jest użytecznym narzędziem w badaniu między innymi procesu dimeryzacji receptorów. W poniższym projekcie laboratoryjnym skupiono się na uzyskaniu genetycznych konstruktów receptora 5-HT2C to jest HaloTag-5-HT2C oraz SNAP-5-HT2C za pomocą technologii Tag-lite, które następnie posłużą do badania dimeryzacji tego receptora za pomocą techniki HTRF.

The 5-HT2C receptor, belonging to the G Protein-Coupled Receptor (GPCR) family, is one of the serotonin binding sites in the human nervous system. Heteromerization of 5-HT2C receptors directly induces ligand affinity change, signaling modification, and may be an important factor in the development of neuropsychiatric disorders. For this reason, the 5-HT2C heteromerization study is of interest to many research projects. Homogenous Time Resolved Fluorescence (HTRF) technology combines standard FRET technology with time-resolved measurement of fluorescence to eliminate fluorescence of the background. This is possible because in this technique, lanthanide ions - europium or terbium, surrounded by heterocyclic rings - are used as the donor of energy. Such a structure, called the cryptate, is characterized by long-lived fluorescence emission, which can be recorded with delay while autofluorescence and medium fluorescence extinguishes. The HTRF technique is a useful tool in the study of the process of receptor heteromerization. The following laboratory project is focused on obtaining 5-HT2C receptor genetic constructs namely HaloTag-5-HT2C and SNAP-5-HT2C using Tag-lite technology, which will then be used to study the dimerization of this receptor by HTRF.