The effect of butylhydroxytoluene on the process of apoptosis in primary culture of hippocampal neurons

Butylohydroksytoluen (BHT) jest lipofilnym antyoksydantem znanym w Unii Europejskiej pod numerem E 321. Ta pochodna fenolu wykorzystywana jest nie tylko jako dodatek do żywności, ale również w wielu produktach codziennego użytku np. kosmetykach lub farmaceutykach. Istnieje wiele doniesień naukowych wskazujących na hepato- oraz pneumotoksyczność BHT, obserwowano też objawy neurologiczne po jego spożyciu w dużej ilości. Jednak wyniki niektórych badań sugerują protekcyjne działanie tego związku na niektóre komórki i narządy.Celem niniejszej pracy było zbadanie wpływu BHT na ośrodkowy układ nerwowy poprzez przeprowadzenie eksperymentu in vitro na neuronach w hodowli pierwotnej. Komórki wyizolowano z płodów mysich i zawieszono w pozbawionym surowicy medium Neurobasal z dodatkiem suplementu B27. Hodowlę prowadzono przez 9-15 dni. Następnie dodawano roztwory BHT (1, 10 i 100 µM) na 24 lub 48 godzin. W celu zbadania wpływu BHT na żywotność neuronów oznaczano poziom dehydrogenazy mleczanowej, potencjał błony mitochondrialnej i aktywność kaspazy 3 metodami biochemicznymi. Ponadto, aby uwidocznić zmiany morfologiczne zachodzące w komórkach po inkubacji z BHT, wykonano barwienie immunofluorescencyjne.Uzyskane wyniki wykazały istotny statystycznie wzrost aktywności uwolnionej do medium hodowlanego dehydrogenazy mleczanowej oraz spadek potencjału błony mitochondrialnej pod wpływem BHT. Zaobserwowano też wzrost aktywności kaspazy 3. Cytotoksyczne działanie BHT na neurony zostało potwierdzone w barwieniu immunofluorescencyjnym.Praca ta przedstawia zależny od dawki cytotoksyczny wpływ BHT na komórki nerwowe w hodowli pierwotnej w modelu krótkotrwałego narażenia. Biorąc pod uwagę otrzymane wyniki oraz szerokie zastosowanie tej substancji, badania nad neurotoksycznością BHT powinny być kontynuowane, również pod względem jego potencjalnej roli w rozwoju chorób neurodegeneracyjnych.

Butylhydroxytoluene (BHT) is a lipophilic antioxidant known in the European Union under E 321 code. This phenol derivative is used not only as a food additive, but also in a wide variety of every-day products i.e. cosmetics and pharmaceuticals.There are many scientific reports that BHT can induce hepato- and pneumotoxic effect, neurological symptoms after ingestion of large amount of BHT were observed as well. However, results of some experiments indicate its potential protective effect on cells and organs.The aim of this work was to investigate the influence of BHT on the central nervous system, using neurons in primary cultures. The cells were isolated from mouse embryos, plated in serum-free Neurobasal medium supplemented with B27 and cultured for 9-15 days. Afterwards, BHT (1, 10 i 100 µM) was added for 24 and 48 hours. To investigate how it affects the central nervous system, the level of released lactate dehydrogenase, mitochondrial membrane potential and caspase 3 activity were measured using appropriate assays. Furthermore, immunofluorescence staining was used to visualize morphological changes in neuron cultures after incubation with BHT.The obtained results indicated statistically significant increase of lactate dehydrogenase and decreased mitochondrial membrane potential. Also increased caspase 3 activity was observed. Cytotoxic impact of BHT on neurons was confirmed by immunofluorescence staining.This study shows dose-dependent cytotoxic influence of BHT on neurons in primary culture in short-term exposure model. Taking the results obtained into account, the investigation of its neurotoxicity should be continued, also in terms of causes of neurodegenerative diseases.