Toll-like receptors in Carpathian and smooth newts

Receptory Toll-podobne (TLR) są grupą białek błonowych należącą do receptorów rozpoznających wzorce (PRR) - molekularne wzorce patogenności(PAMP). Pełnią one bardzo ważną funkcję w odporności nieswoistej zwierząt oraz stanowią łącznik między układami odporności wrodzonej i nabytej. Zbudowane są z części zewnątrzkomórkowej, zawierającej liczne motywy bogate w leucynę (LRR), odpowiedzialną za rozpoznawanie PAMP, domeny transbłonowej oraz Toll/Interleukina-1 (TIR), przekazującej sygnał do wnętrza komórki. Praca niniejsza w zasadniczym stopniu dotyczy płazów (Amphibia) obecnie w wielu regionach świata zagrożonych wyginięciem. Najlepiej poznane repertuary TLR pochodziły od żab szponiastych, natomiast brakowało danych pochodzących od płazów ogoniastych, które ewoluują niezależnie od innych kręgowców od około 300 mln lat.Celem pracy było poznanie repertuaru TLR płazów ogoniastych z rodzaju Lissotriton (L. montandoni i L. vulgaris) i porównanie go z innymi gromadami kręgowców, a także z płazami bezogonowymi. Identyfikacja receptorów w transkryptomach, uzyskanych dzięki technice Illumina HiSeq 2000 i ich dalsze analizowanie, dokonane zostały dzięki zastosowaniu różnych narzędzi bioinformatycznych. Podczas prac nad sekwencjami traszek opublikowane zostały liczne transkryptomy innych płazów, które włączono do pracy. U płazów ogoniastych odnaleziono 17 receptorów, przedstawicieli podrodzin charakterystycznych zarówno dla ryb jak i dla owodniowców. Spośród poznanych repertuarów TLR najbliższe traszkom są zestawy żab szponiastych. Odnotowano obecność TLR4 w transkryptomie kumaka oraz jego brak u ogoniastych, odpowiedzialnego u owodniowców za rozpoznawanie lipopolisacharydu. W transkryptomach traszek odnaleziono charakterystyczne dla ryb TLR19 oraz dwa zduplikowane receptory: 9 i 22. W transkryptomach traszek odnaleziono ponadto receptory o numerach 13, 14, 21 i 22, a nie odnaleziono typowo ssaczych 6, 10 i 11 oraz znanego tylko u ryb TLR18. U płazów odnaleziono członka rodziny TLR5, nieposiadającego domeny TIR, którego nie łączy relacja ortologii z „rozpuszczalnymi” TLR5S ryb. Przynależność receptorów do podrodzin potwierdziła analiza filogenetyczna. Większość odtworzonych architektur domenowych pokrywa się z planem budowy typowego TLR. W kilku przypadkach występują zmiany, takie jak obecność zera, dwóch lub więcej domen transbłonowych. Repertuar TLR traszek jest zbliżony do prezentowanego u Xenopus laevis i stanowi zbiór pośredni pomiędzy TLR owodniowców i ryb, zawierając produkty zarówno starych duplikacji, utrwalone u wszystkich kręgowców, jak i nieco nowsze geny, charakterystyczne dla niższych taksonów. Część z nich może być produktami ekspresji pseudogenów. Do TLR powstałych w wyniku duplikacji charakterystycznych dla Salamandridae, które usiały zajść przed rozdzieleniem się rodzajów Lissotriton i Notophthalmus, a utrwalonych przez dobór pozytywny, zaliczyć można TLR9A i 9B oraz TLR22A i 22B. TLR6 nie jest prezentowany u płazów i gadów, ale można u nich zaobserwować podobną do ssaczej duplikację wewnątrz rodziny TLR1, w wyniku której powstały TLR6, czy TLR10. Receptory płazów mają typową dla badanej rodziny receptorów architekturę domenową. Brak lub słaba rekonstrukcja receptorów płazów bezogonowych innych niż Xenopus może mieć związek z innym środowiskiem życia, i brakiem ekspresji zbędnych genów ulegających ekspresji u ich rybich przodków.

Toll-like receptors (TLRs) are a group of membrane proteins belonging to the pattern-recognition receptors (PRR). TLRs recognize pathogen associated molecular patterns (PAMP). They play a very important role in the innate animals’ immunity and provide a link between the innate and acquired immune systems. They consist of the extracellular part containing multiple leucine-rich repeats (LRR) responsible for PAMP recognition, transmembrane domain and Toll/interleukin-1 receptor domain (TIR) , transmitting a signal to the cell. The present work is essentially referred to amphibians (Amphibia), which are threatened with extinction, in many regions of the world. The best known TLR repertoires was derived from genus Xenopus in opposition to Urodela that has evolved independently from other vertebrates since about 300 millions of years.The aim of the study was to investigate the repertoire of TLR presented in amphibians of the genus Lissotriton (L. montandoni and L. vulgaris) and comparing it with other clusters of vertebrates and anurans. The identification of receptors in transcriptomes, obtained with the technique Illumina HiSeq 2000, and their subsequent analysis , were made by using various bioinformatics tools. During the work, numerous reference transcriptomes, which were incorporated into the dissertation, were published.Transcripts of 17 TLR genes were identified in Salamandridae transcriptome. They are representatives of the subfamilies, which are characteristic both for fish and for amniotes. Among the known repertoires of TLRs newts and clawed frogs are the most similar. TLR4, which recognizes lipopolisaccharide in amniota, was identified in transcriptome of genus Bombina, but not in Urodela. A fish characteristic TLR19 and two duplicated receptors(9 & 22) were identified in Lissotriton. TLR13, 14, 21 were also identified in newt transcritomes unlike characteristic of mammals TLR6, 10 & 11 and 18 present in fish. A TIR lacking TLR5 family member was present in amphibians transcriptomes, which is not ortologous with fish “soluble” TLR5S. A TLRs belongingness to subfamilies was confirmed by phylogenetic analysis. Most of the reconstructed domain architectures coincide with the planned construction of a typical TLR. In some cases, there are aberrations, such as the presence of zero, two or more transmembrane domains.The set of TLR presented in newts’ transcriptomes is the most similar to Xenopus repertoire. It contains products of old vertebrate duplications maintained by selection, but also more recent genes, typical for genera, which could be pseudogenes. TLR9A, 9B & 22A, 22B can be considered as TLRs belonging to Salamandridae characteristic duplications, predating the divergence of genera Notophthamus and Lisotriton. They are still maintained by natural selection . TLR6 is not presented in amphibians and in reptiles, but in them we can observe a similar to mammalian TLR1 duplication within the subfamily, which can be seen as the basis of the creation of TLR6 or TLR10. Amphibians’ TLRs have a typical to this family domain architecture. The incomplete reconstruction or the absence of some receptors in anuran species, other than clawed frogs, may be related to more terrestrial lifestyle. The lack of “fish” TLR expression could not impact on their fitness.