Monitoring DNA repair pathways in human induced pluripotent stem cells using a fluorescent molecular reporter.

Indukowane pluripotencjalne komórki macierzyste (ang. induced pluripotent stem cells, iPSCs) są to komórki otrzymywane w wyniku reprogramowania komórek somatycznych czynnikami transkrypcyjnymi istotnymi dla utrzymania stanu pluripotencjalności. Ze względu na zdolność iPSCs do potencjalnie nielimitowanej liczby podziałów komórkowych oraz do różnicowania w komórki wszystkich trzech listów zarodkowych, tj. endodermy, mezodermy i ektodermy, stanowią one niezwykle przydatne narzędzie, zarówno w nauce, jak i w medycynie. Jednakże, aby potencjalne zastosowanie iPSCs u pacjentów było bezpieczne, a badania naukowe z ich użyciem miarodajne, niezbędne jest utrzymanie stabilności genetycznej tych komórek w hodowli. Ze stabilnością genetyczną iPSCs nieodłącznie związana jest ich zdolność do naprawy dwuniciowych pęknięć DNA (ang. double-strand breaks, DSB), jako, że uszkodzenia te mogą prowadzić nawet do śmierci komórek. Istnieją dwa główne mechanizmy naprawy DSB: homologiczna rekombinacja (ang. homologous recombination, HR) oraz niehomologiczne łączenie końców (ang. non-homologous end-joining, NHEJ). W przypadku HR, do naprawy DSB potrzebna jest sekwencja homologiczna, dzięki czemu naprawa jest bardziej dokładna. Z kolei w przypadku NHEJ, sekwencja homologiczna nie jest potrzebna, ale do sekwencji DNA mogą zostać wprowadzone małe insercje bądź delecje. Wykazano, że czynniki środowiskowe, takie jak temperatura czy stężenie tlenu w hodowli, mogą wpływać na częstość zachodzenia HR i NHEJ w iPSCs. Jednak w celu dokładnego zbadania tego zjawiska, konieczna jest odpowiednia metoda monitorowania szlaków naprawy DNA w iPSCs.W niniejszej pracy, wykorzystano fluorescencyjny reporter molekularny umożliwiający monitorowanie szlaków naprawy DNA w komórkach. W obrębie reportera, przy pomocy meganukleazy SceI indukowane są DSB, które następnie mogą być naprawione przy udziale HR bądź NHEJ. Wnioskowanie o częstości występowania tych szlaków w komórkach możliwe jest na podstawie fluorescencji komórek – zielonej, pochodzącej od białka wzmocnionej zielonej fluorescencji (ang. enhanced green fluorescent protein, EGFP) w przypadku zajścia HR, i czerwonej, pochodzącej od białka mCherry w przypadku naprawy DNA mechanizmem NHEJ. Funkcjonalność reportera została potwierdzona z zastosowaniem linii HEK293T. Wykazano, że komórki te naprawiają uszkodzenia DNA głównie z użyciem szlaku NHEJ (882-3331/105 komórek), a w znacznie mniejszym stopniu korzystają ze szlaku HR (5-7/105 komórek). W przypadku iPSCs, w eseju episomalnym nie udało się zaobserwować komórek wykazujących czerwoną lub zieloną fluorescencję. Aby możliwe było efektywne monitorowanie szlaków naprawy DNA w iPSCs w różnych warunkach środowiskowych, przygotowano dwie linie komórek iPS ze stabilnie wbudowanym fluorescencyjnym reporterem naprawy DNA w locus AAVS1, przy pomocy systemu CRISPR/Cas9 (ang. Clustered Regularly-Interspaced Short Palindromic Repeats/CRISPR associated protein 9). Poprawność wbudowania konstruktu potwierdzono przy pomocy reakcji PCR (ang. polymerase chain reaction). DSB indukowano poprzez wprowadzenie do komórek plazmidu kodującego nukleazę SceI metodą nukleofekcji. Niestety, mimo skutecznej nukleofekcji, w liniach iPSCs ze stabilnie wbudowanym reporterem, również nie udało się zaobserwować zielonej lub czerwonej fluorescencji. Przyczyn może być kilka, m.in wyciszenie epigenetyczne sekwencji promotora w obrębie reportera lub toksyczność nukleazy SceI. Jednakże w celu dokładniejszego zweryfikowania, na którym etapie funkcjonowania reportera dochodzi do nieprawidłowości, konieczne są dalsze badania.

Induced pluripotent stem cells (iPSCs) are obtained by reprogramming somatic cells with transcription factors essential for maintaining cell pluripotency. Due to the capacity of iPSCs to potentially unlimited number of cell divisions and to differentiation into the cells of all three germ layers: endoderm, mesoderm and ectoderm, they constitute an extremely useful tool in both science and medicine. However, in order to make the use of iPSCs in patients safe, and to obtain reliable results in scientific research, it is necessary to maintain genetic stability of iPSCs in culture. The genetic stability of iPSCs is inherently linked to their ability to repair double-strand breaks (DSBs), lesions which may lead to cell death. There are two main DSB repair pathways: homologous recombination (HR) and non-homologous end-joining (NHEJ). In case of HR, a homologous sequence is needed for DNA repair, leading to accurate reconstitution of DNA sequence. On the contrary, repair with NHEJ does not utilize homologous sequence, but introduces small insertions or deletions to the DNA. It has been shown that environmental factors, such as temperature or oxygen concentration in culture, can affect the frequency of HR and NHEJ in iPSCs. However, in order to thoroughly investigate this processes, an appropriate method of monitoring DNA repair pathways in iPSCs is necessary.This work describes the use of a fluorescent molecular reporter that allows monitoring DNA repair pathways in cells. DSBs are induced within the reporter by meganuclease SceI, and they may be repaired by HR or NHEJ mechanism. Frequency of pathways utilization can be monitored on the basis of cell’s fluorescence – green, coming from enhanced green fluorescent protein (EGFP) in case of HR and red, coming from mCherry protein in case of DNA repair by NHEJ.The functionality of DNA repair reporter was confirmed in HEK293T cells. It has been demonstrated that these cells repair DSBs mainly via NHEJ (882-3331/105 cells) and in minority via HR (5-7/105 cells), which was indicated by red and green fluorescence, respectively. In the case of iPSCs, functionality of the reporter failed to be confirmed in episomal essay.In order to effectively monitor DNA repair pathways in iPSCs under different environmental conditions, two iPS cell lines with stably integrated fluorescent molecular reporter at AAVS1 locus were generated, using the CRISPR/Cas9 (ang. Clustered Regularly-Interspaced Short Palindromic Repeats/CRISPR associated protein 9) system. The correctness of construct integration was confirmed by PCRs (polymerase chain reactions). DSBs were induced by introducing the plasmid encoding SceI nuclease to the cells by nucleofection. Unfortunately, despite the success of nucleofection, functionality of the reporter stably integrated in iPSCs lines was not observed. There may be a few explanations, such as epigenetic silencing of promoter sequences within the reporter or toxicity of SceI nuclease. However, to verify which step in the process of monitoring DNA repair pathways in iPSCs is not functional, further research is needed.