Study of interactions of selected drugs with genetically modified variants of beta-lactoglobulin

β-laktoglobulina to niewielkie białko należące do rodziny lipokalin. Białka z tej rodziny zaangażowane są głównie w transport niewielkich hydrofobowych cząsteczek wewnątrz β-baryłki układającej się w kształt kielicha. Modyfikowanie lipokalin za pomocą metod inżynierii genetycznej dało początek antykalinom, cząsteczkom projektowanym na bazie struktury lipokalin, których specyficzność względem liganda zależy od wprowadzonych mutacji.Niniejsza praca jest kontynuacją badań nad β-laktoglobuliną, której właściwa funkcja nie została jeszcze odkryta, jednak jej domniemaną rolą w organizmie jest transport kwasów tłuszczowych. Wprowadzanie mutacji w obrębie kieszeni wiążącej ligand to podejście, w którym BLG zmienia swoje powinowactwo i specyficzność względem cząsteczek aktywnych biologicznie, takich jak leki. Na podstawie dotychczas istniejących danych zaproponowano warunki, w których możliwe jest zbadanie oddziaływania osiemnastu wybranych mutacji BLG z wybranymi lekami oraz analiza mechanizmu wiązania tych związków. Badania skupiły się na analizie sygnału fluorescencji pochodzącej od cząsteczki ANS, która poprzez niekowalencyjne oddziaływania z białkiem konkuruje z cząsteczką liganda o miejsce wiązania wewnątrz kielicha. Analiza obejmowała także badanie sygnału fluorescencji pochodzącego od reszty Trp19, która znajduje się wewnątrz kieszeni wiążącej i nie jest eksponowana do środowiska hydrofilowego. Zastosowanie NaI jako związku wygaszającego fluorescencję nie przyniosło oczekiwanych rezultatów, a kowalencyjnie wiążące się do reszty cysteinowej BLG znaczniki destabilizowały strukturę białka. Pomiary widm CD pozwoliły na obserwację zmian w strukturze trzeciorzędowej białka w rosnącym gradiencie stężenia liganda.

β-lactoglobulin is a small protein belonging to the family of lipocalins. The majority of lipocalins are carrier proteins for small hydrophobic molecules, that are bound inside their calyx shaped β-barrel. Genetically engineered lipocalins are being called antycalins, molecules which structure is based on lipocalins, with their specificity to various ligands may vary depending on applied mutations.Presented work is continuation of research on β-lactoglobulin, with its proper role not yet reported, but its most supposed role is transportation of fatty acids. Point mutations introduced to the ligand binding site is an approach, in which BLG can be employed as a protein binding biologically active hydrophobic substances, e.g. drugs with changes specificity and affinity. Based on currently known data, specific conditions were chosen, in which the mechanism of drug binding of eighteen recombinant proteins was analysed. Research focused on analysis of ANS molecule fluorescence, which binds to protein non-covalently and competes with ligand for binding site inside the calyx of protein. Fluorescence of Trp19 was also measured, it is located inside β-barrel, therefore it is not exposed to hydrophobic environment. Approach that involved use of NaI as a fluorescence quenching molecule didn not lead to expected results, and fluorescent markers bound covalently to the cysteine in BLG destabilized the structure of protein. Measurements of CD spectra contributed to analysis of changes in tertiary structure of BLG protein against gradient of ligand concentration.