N-glycosylation as a factor modulating the effect exerted by ectosomes released by thyroid cancer cells on normal cells

Nowotwór tarczycy jest najczęściej występującym nowotworem układu endokrynnego, a częstość zachorowań na niego wykazuje stałą tendencję wzrostową. Pomimo stosunkowo dobrego rokowania w przypadku większości nowotworów zróżnicowanych, takich jak rak brodawkowaty czy pęcherzykowy, niektóre typy, jak rak anaplastyczny, charakteryzują się wysoką agresywnością i ograniczoną skutecznością leczenia. Większość przypadków raka tarczycy, zdiagnozowanych we wczesnym stadium skutecznie leczy się zabiegami chirurgicznymi, jodem promieniotwórczym oraz terapią supresyjną hormonem TSH. Z uwagi na zróżnicowany charakter biologiczny nowotworów tarczycy oraz brak specyficznych markerów diagnostycznych, jednym z obiecujących kierunków badań są mikropęcherzyki zewnątrzkomórkowe (EV) wydzielane przez komórki nowotworowe. Do EV należą ektosomy powstające bezpośrednio poprzez pączkowanie i oderwanie się od błony komórkowej. Są one nośnikami różnorodnych cząsteczek biologicznych, takich jak białka, lipidy, kwasy nukleinowe, a ich cargo odzwierciedla stan fizjologiczny komórki przez którą są uwalniane.Coraz więcej danych wskazuje, że ekstosomy odgrywają ważną rolę w komunikacji międzykomórkowej w środowisku nowotworowym, modulując odpowiedź immunologiczną, angiogenezę, przerzuty i oporność na leczenie. Jednym z kluczowych elementów wpływających na funkcje biologiczną komórek, jak i uwalnianych przez nie EV, jest profil ich glikozylacji. Glikozylacja jest procesem enzymatycznym, w którym reszty cukrowe przyłączane są do białek, lipidów i kwasów nukleinowych. Nieprawidłowa glikozylacja jest dobrze udokumentowanym zjawiskiem stwierdzanym w chorobach nowotworowych, a zmiany w strukturze glikanów mogą sprzyjać transformacji nowotworowej, nasilać potencjał migracyjny, inwazyjny, tworzenie przerzutów oraz promować przeżywalność komórek nowotworowych.Celem niniejszej pracy było zbadanie, czy zmiany glikozylacji obserwowane w komórkach prawidłowych i nowotworowych tarczycy znajdują odzwierciedlenie w ektosomach przez nie uwalnianych, oraz czy modyfikacja struktury glikanów w ektosomach ma wpływ na żywotność i właściwości migracyjne komórek docelowych. W badaniach wykorzystano trzy linie komórkowe: prawidłowe tyreocyty (Nthy-ori 3-1), komórki pęcherzykowego raka tarczycy (FTC) oraz anaplastycznego raka tarczycy (8305c). W celu modyfikacji profilu glikozylacji, komórki hodowano w obecności tunikamycyny, hamującej przeniesienie prekursorowego N-glikanu na nowo syntetyzowany peptyd. Profil glikozylacji komórek oraz uwalnianych przez nie ekstosomów izolowanych z pożywek kondycjonowanych, analizowano metodą spektralnej cytometrii z użyciem lektyn. Wpływ ektosomów na tyreocyty oceniano przy użyciu testu gojenia ran (badanie właściwości migracyjnych) oraz testu Alamar Blue (ocena żywotności). Wykazano, że profile glikozylacji komórek i uwalnianych przez nie ektosomów nie były takie same, a obecność tunikamycyny w pożywce hodowlanej w różny sposób wpływała na komórki i ektosomy. Ekstosomy uwalniane przez komórki nowotworowe, w zależności od profilu ich glikozylacji i typu linii nowotworowej, w odmienny sposób wpływały na żywotność i zdolności migracyjne tyreocytów. Uzyskane wyniki potwierdzają, że analiza struktury glikanów ektosomów może nie tylko wspierać wczesne wykrywanie i klasyfikację nowotworów tarczycy, ale również przyczynić się do lepszego zrozumienia mechanizmów ich progresji i interakcji z mikrośrodowiskiem guza. Dodatkowo profil glikozylacji ektosomów może stanowić potencjalne źródło nowotworowych markerów diagnostycznych oraz funkcjonalnych.

Thyroid cancer is the most common cancer of the endocrine system, and its incidence is steadily increasing. Despite a relatively good prognosis for most differentiated cancers, such as papillary or follicular cancer, some types, such as anaplastic cancer, are highly aggressive and difficult to treat effectively. Most cases of thyroid cancer diagnosed at an early stage are effectively treated with surgery, radioactive iodine, and TSH hormone suppression therapy. Due to the diverse biological nature of thyroid cancers and the lack of specific diagnostic markers, one promising area of research is extracellular vesicles (EV) secreted by cancer cells. EV include exosomes, which are formed directly through budding and detachment from the cell membrane. They are carriers of various biological molecules, such as proteins, lipids, and nucleic acids, and their cargo reflects the physiological state of the cell through which they are released.There is growing evidence that exosomes play an important role in intercellular communication in the tumor microenvironment, modulating the immune response, angiogenesis, metastasis, and resistance to treatment. One of the key elements influencing the biological functions of cells and the EV they release is their glycosylation profile. Glycosylation is an enzymatic process in which sugar residues are attached to proteins, lipids, and nucleic acids. Abnormal glycosylation is a well-documented phenomenon found in cancer, and changes in the structure of glycans can promote cancerous transformation, increase their migratory and invasive potential, promote metastasis, and enhance their survival.The aim of this study was to investigate whether changes in glycosylation observed in normal and cancerous thyroid cells are reflected in the ectosomes released by them, and whether modification of the structure of glycans in ectosomes affects the viability and migratory properties of target cells. Three cell lines were used in the study: normal thyrocytes (Nthy-ori 3-1), follicular thyroid carcinoma (FTC) cells, and anaplastic thyroid carcinoma (8305c) cells. In order to modify the glycosylation profile, the cells were cultured in the presence of tunicamycin, which inhibits the transfer of the precursor N-glycan to the newly synthesized peptide. The glycosylation profile of the cells and the exosomes released by them, isolated from conditioned media, was analyzed by spectral cytometry using lectins. The effect of exosomes on thyrocytes was assessed using a wound healing test (migration properties test) and the Alamar Blue test (viability assessment). It was shown that the glycosylation profiles of cells and the exosomes released by them were not the same, and the presence of tunicamycin in the culture medium affected cells and exosomes in different ways. Exosomes released by cancer cells, depending on their glycosylation profile and cancer cell line type, affected the viability and migratory abilities of thyrocytes in different ways. The results obtained confirm that the analysis of the structure of ectosome glycans may not only interfere with the early detection and classification of thyroid tumors, but also contribute to a better understanding of the mechanisms of their progression and interaction with the tumor microenvironment. In addition, the glycosylation profile of exosomes may be a potential source of diagnostic and functional cancer markers.