The role of lncRNA NORAD in the repair of DNA breaks induced by X-ray irradiation

Długie niekodujące RNA (ang. long non-coding RNA lncRNA) stanowią szeroką i zróżnicowaną klasę regulatorowych cząsteczek RNA, z których wiele pozostaje niezidentyfikowanych lub słabo scharakteryzowanych. Wśród lncRNA, których funkcje pozostają wciąż nie do końca poznane, NORAD (ang. Noncoding RNA Activated by DNA Damage) przyciąga szczególną uwagę ze względu na wysoki poziom ekspresji w komórkach ssaków oraz konserwatyzm sekwencji. Dotychczasowe badania podkreślają znaczenie NORAD w zachowaniu stabilności genomowej. NORAD na terenie cytoplazmy funkcjonuje jako gąbka molekularna dla białek z rodziny PUM, sekwestrując ich określoną frakcję i zapobiegając nadmiernej degradacji transkryptów kluczowych dla procesu mitozy, regulacji cyklu komórkowego i naprawy DNA. W wyniku uszkodzeń DNA, NORAD może translokować do jądra komórkowego, gdzie wchodzi w interakcję z białkiem RBMX. Oddziaływanie NORAD-RBMX jest niezbędne do utworzenia kompleksu rybonukleoproteinowego NARC1 (ang. NORAD-activated ribonucleoprotein complex 1), który uczestniczy w stabilizacji struktur chromosomowych. Co ciekawe, NORAD wspiera progresję nowotworu oraz przyczynia się do rozwoju mechanizmów oporności na terapie. Celem niniejszej pracy magisterskiej było zbadanie roli lncRNA NORAD w naprawie pęknięć DNA indukowanych promieniowaniem X. W badaniach wykorzystano linie komórkowe HeLa oraz HCT116 z wyciszonym genem NORAD metodą CRISPRi. Analizy ilościowe pęknięć DNA w komórkach poddanych działaniu promieniowania X wskazują, że NORAD pełni ważną rolę w mechanizmach naprawy DNA. Wyciszenie lncRNA NORAD zmniejsza efektywność mechanizmów naprawczych i prowadzi do akumulacji uszkodzeń DNA. Co więcej, komórki z wyciszoną ekspresją NORAD są bardziej wrażliwe na radioterapię. Efekt działania NORAD może zależeć od kontekstu komórkowego. NORAD może stanowić obiecujący cel terapii przeciwnowotworowych, jednak jego rola w naprawie pęknięć DNA nie została jeszcze w pełni wyjaśniona i wymaga dalszych, szczegółowych badań ukierunkowanych na poznanie molekularnych mechanizmów jego działania.

Long non-coding RNAs (lncRNAs) constitute a broad and heterogeneous class of regulatory RNA molecules, many of which remain unidentified or poorly characterized. Among lncRNAs whose functions remain poorly understood, NORAD (Noncoding RNA Activated by DNA Damage) stands out due to its abundant expression in mammalian cells and strong sequence conservation, suggesting a potentially important biological role. Previous studies have demonstrated the critical role of NORAD in the maintenance of genomic stability. NORAD functions as a molecular scaffold for the PUMILIO proteins, sequestering a significant fraction of these proteins and thereby preventing the excessive repression of key regulators involved in mitosis, DNA repair, and DNA replication. Following DNA damage, NORAD translocates to the nucleus, where it interacts with the RBMX protein. The interaction between NORAD and RBMX enables the formation of the NARC1 complex (NORAD-Activated Ribonucleoprotein Complex 1), which plays a crucial role in stabilizing chromosomal structures. Notably, NORAD facilitates tumor progression and plays a significant role in the establishment of mechanisms underlying therapeutic resistance. The aim of this master's thesis was to investigate the role of NORAD in the repair of DNA breaks induced by X-ray irradiation. To this end, HeLa and HCT116 cell lines with NORAD silencing via CRISPR interference (CRISPRi) were established. Quantitative analyses of DNA damage in irradiated cells revealed that NORAD plays a significant role in DNA repair processes. Silencing of NORAD impaired repair efficiency, leading to the accumulation of DNA lesions. Furthermore, NORAD-depleted cells exhibited increased sensitivity to radiotherapy. The effect of NORAD may be cell line-dependent. Altogether, these findings suggest that NORAD may represent a promising target for cancer therapy. Despite current knowledge, the role of NORAD in DNA repair is not fully understood and demands more comprehensive research focused on elucidating its molecular basis.