Phenotypic and molecular aspects of the oxidative stress response in endothelial cells derived from the microvasculature of donor hearts with type 2 diabetes mellitus

Cukrzyca typu 2 jest chorobą, która coraz częściej dotyka ludzi na świecie. Charakterystyczną cechą cukrzycy typu 2 jest insulinooporność, sprzyjająca hiperglikemii. Wysokie stężenie glukozy prowadzi do nieenzymatycznej glikacji białek inicjując procesy zapalne, sprzyjając jednocześnie zwiększeniu poziomu stresu oksydacyjnego. Nieleczona choroba prowadzi do wielu powikłań jej towarzyszących takich jak: niedokrwienie i martwica kończyn, udar mózgu, zawał serca, miażdżyca, nadciśnienie tętnicze, niewydolność nerek. Czynnikami wpływającymi w głównej mierze na rozwój cukrzycy są: wiek, płeć, otyłość, brak aktywności fizycznej oraz dodatni wywiad rodzinny w kierunku cukrzycy i predyspozycje genetyczne. Celem niniejszej pracy była charakterystyka fenotypowa i molekularna komórek śródbłonka z mikrokrążenia serca (HCMEC – ang. human cardiac microvascular endothelial cells) dawcy zdrowego oraz dawcy z cukrzycą typu 2 hodowanych w warunkach podstawowych oraz w warunkach stresu oksydacyjnego (stymulacja nadtlenkiem wodoru). Charakterystyki komórek HCMEC dokonano poprzez zbadanie ekspresji wybranych genów, analizę fenotypu sekrecyjnego związanego ze starzeniem (SASP – ang. senescence associated secretory phenotype), pomiar aktywności mitochondrialnej (test MTT) oraz badanie poziomu reaktywnych form tlenu (ROS – ang. reactive oxygen species) z wykorzystaniem znacznika fluorescencyjnego. W oparciu o uzyskane wyniki w hodowli komórek HCMEC od dawcy z cukrzycą typu 2 w warunkach podstawowych stwierdzono większą liczbę komórek senescentnych i większą produkcję wybranych komponentów SASP (IL-6, IL-8), niższą ekspresję genów zaangażowanych w odpowiedź komórek na stres oksydacyjny, niższą aktywność mitochondrialną oraz niższą produkcję ROS w porównaniu do komórek HCMEC od zdrowego dawcy. Pod wpływem stresu oksydacyjnego w obu liniach komórkowych obserwowano spadek aktywności mitochondrialnej oraz zmniejszenie produkcji IL-8, co mogło wiązać się ze zmniejszoną żywotnością. Ponadto, krótkotrwała ekspozycja komórek HCMEC od dawcy z cukrzycą na nadtlenek wodoru spowodowała wzrost poziomu wewnątrzkomórkowych ROS przy niezmienionej ekspresji genów antyoksydacyjnych (HMOX1, GCLM). Natomiast w komórkach HCMEC od zdrowego dawcy ekspresja ww. genów była nieznacznie podniesiona, a poziom wewnątrzkomórkowych ROS nie uległ zmianie w porównaniu do komórek nietraktowanych. Uzyskane wyniki sugerują, że komórki HCMEC od dawcy z cukrzycą typu 2 wykazują cechy przedwczesnej senescencji już w warunkach podstawowych. Uzyskane wyniki świadczą ponadto o upośledzonej zdolności komórek cukrzycowych do neutralizacji stresu oksydacyjnego, prawdopodobnie na skutek niewystarczającej aktywacji genów antyoksydacyjnych.

Type 2 Diabetes (T2D) is a disease that is increasingly affecting people worldwide. A characteristic feature of T2D is insulin resistance, which promotes hyperglycemia. Elevated glucose levels lead to non-enzymatic glycation, initiating inflammatory processes and simultaneously increasing oxidative stress. If left untreated, diabetes can result in numerous associated diseases and complications such as: limb necrosis, stroke, myocardial infarction, atherosclerosis, hypertension, kidney failure. The main factors influencing the development and progression of diabetes include age, sex, obesity, lack of physical activity, positive family history of diabetes and genetic predisposition. The aim of this study was to perform a phenotypic and molecular characterization of human cardiac microvascular endothelial cells (HCMEC) derived from a healthy donor and a donor with type 2 diabetes, cultured under both basal conditions and under oxidative stress (induced by hydrogen peroxide). The characterization of HCMEC included the analysis of selected gene expression, the assessment of senescence-associated secretory phenotype (SASP), the measurement of mitochondrial activity (MTT assay), and the analysis of reactive oxygen species (ROS) levels using fluorescent probe. Based on the obtained results, HCMEC from a donor with type 2 diabetes cultured under basal conditions exhibited a higher number of senescent cells and increased production of selected SASP components (IL-6, IL-8), lower expression of genes involved in the cellular response to oxidative stress, reduced mitochondrial activity, and decreased ROS production compared to HCMEC from a healthy donor. Under oxidative stress, both cell lines showed a decrease in mitochondrial activity and decreased production of IL-8, which may be associated with reduced cell viability. Furthermore, short-term exposure of HCMEC from the diabetic donor to hydrogen peroxide resulted in an increase in intracellular ROS levels without changes in the expression of antioxidant genes (HMOX1, GCLM). In contrast, HCMEC from the healthy donor showed a slight upregulation of these genes, with no change in intracellular ROS levels when compared to untreated cells.These findings suggest that HCMEC from the type 2 diabetic donor exhibit features of premature senescence already under basal conditions. Moreover, the results indicate an impaired ability of diabetic endothelial cells to counteract oxidative stress, likely due to insufficient activation of antioxidant gene expression.