Development of a genetic construct and optimization of the production of recombinant plastocyanin, along with its cysteine muteins

Mechanizmy przekształcania energii chemicznej lub świetlnej do form biologicznie użytecznych są podstawą życia na Ziemi. Przemiana energii opiera się przede wszystkim na translokacji protonów w poprzek błony oraz transferze elektronów w błonach tylakoidów chloroplastów, wewnętrznej błonie mitochondrium oraz błonie komórkowej bakterii.Plastocyjanina (PC) jest małym białkiem, pełniącym rolę mobilnego transportera elektronów w fotosyntetycznym łańcuchu transportu elektronów. W swojej strukturze posiada atom miedzi, który jest koordynacyjnie związany z czterema aminokwasami - histydyny-37, histydyny-87, cysteiny-84 oraz metioniny-92. Atom miedzi, zmieniając swój stopień utlenienia, umożliwia zarówno przyjęcie elektronu pochodzącego od kompleksu cytochromów b6f, jak i przekazanie elektronu na fotosystem I. Molekularne mechanizmy tych procesów nie są poznane dogłębnie, co stanowi interesujący obiekt badań naukowych.Głównym celem niniejszej pracy było utworzenie konstruktu genetycznego, który umożliwia wydajną ekspresję plastocyjaniny ze szpinaku w bakteriach E. coli, a następnie wprowadzenie dwóch mutacji punktowych: substytucję glicyny w pozycji 8 na cysteinę (G8C), oraz analogiczną substytucję glicyny w pozycji 49 (G49C). Utworzenie takiego konstruktu wymagało opracowanie i zoptymalizowanie protokołów izolacji i oczyszczania PC, oraz optymalizację warunków hodowlanych bakterii E. coli.Uzyskanie mutein G8C oraz G49C umożliwiłoby wykorzystanie techniki SDSL-EPR w celu głębszego zbadania i zrozumienia interakcji, które zachodzą między PC a cyt. b6f. Niestety, uzyskana muteina G8C charakteryzowała się wysoką niestabilnością w warunkach laboratoryjnych, natomiast nie udało się uzyskać ekspresji muteiny G49C. Wpływ na wysoką niestabilność muteiny G8C oraz na brak ekspresji muteiny G49C może mieć typ wprowadzanej mutacji – cysteina jest aminokwasem posiadającym grupę tiolową -SH, która w warunkach utleniających tworzy tzw. mostki disiarczkowe. Jednym z aminokwasów które tworzą wiązanie koordynacyjne z atomem miedzi w strukturze PC jest właśnie cysteina, stąd być może następuje niespecyficzne utworzenie mostku disiarczkowego, co uniemożliwia przyjęcie prawidłowej struktury PC.

Mechanisms of converting chemical or light energy into biologically useful forms are the basis of life on Earth. Energy conversion is based primarily on proton translocation across the membrane and electron transfer in the membranes of chloroplast thylakoids, the inner membrane of the mitochondria and the membrane of bacterial cells.Plastocyanin is a small protein that acts as a mobile electron transporter in the photosynthetic electron transport chain. In its structure it has a copper atom, which is coordinately bound to four amino acids - histidine-37, histidine-87, cysteine-84 and methionine-92. The copper atom, by changing its oxidation state, enables both the acceptance of an electron coming from the cytochrome b6f complex and the transfer of an electron to photosystem I. The molecular mechanisms of these processes are not known in-depth, which is an interesting target for scientific research.The main goal of the present study was to establish a genetic construct that enables efficient expression of spinach plastocyanin in E. coli bacteria, followed by the incorporation of two-point mutations: a substitution of glycine at position 8 for cysteine (G8C), and an analogous substitution of glycine at position 49 (G49C). The creation of such a construct required the development and optimization of PC isolation and purification protocols, and the optimization of E. coli culture conditions.Obtaining mutein G8C and G49C would enable the use of the SDSL-EPR technique to further explore and understand the interactions that occur between PC and cyt. b6f. Unfortunately, the resulting G8C mutein was highly unstable under laboratory conditions, while the expression of G49C mutein could not be obtained. The high instability of mutein G8C and the lack of expression of mutein G49C may be affected by the type of mutation introduced - cysteine is an amino acid that has a thiol group -SH, which forms so-called disulfide bridges under oxidizing conditions. One of the amino acids that form a coordination bond with the copper atom in the PC structure is precisely cysteine, hence perhaps non-specific formation of the disulfide bridge occurs, preventing the adoption of the correct PC structure.