Application of microarrays to assess the methylation of mouse genome- technical aspects of the analysis.

Metylacja to epigenetyczna modyfikacja DNA, której podlegać mogą genomy ssaków. Rola metylacji DNA w funkcjonowaniu genomu polega na wyciszaniu ekspresji genów poprzez modyfikację miejsc zwanych wyspami CpG. Najważniejsze procesy biologiczne, działające w oparciu o metylację DNA to: inaktywacja chromosomu X, rodzicielski imprinting oraz transformacja nowotworowa. Wiele technik biologii molekularnej umożliwia ocenę stopnia metylacji DNA, zarówno w skali całego genomu, jak również konkretnie zdefiniowanych jego fragmentów. Prezentowana praca miała na celu przedstawienie technicznych aspektów oraz optymalizację warunków eksperymentu analizy metylacji genomu mysiego z zastosowaniem techniki mikromacierzy DNA. W celu wykazania istotnych różnic i trudności w kluczowych etapach doświadczenia wykorzystano tkanki mózgu, płuc oraz tkanki siatkówki mysiej. Analizę mikromacierzową standaryzowano w oparciu o wytyczne protokołu firmy Agilent Technologies „Agilent Microarray Analysis of Methylated DNA immunoprecipitation”. Szczególną uwagę poświęcono etapom: izolacji DNA, fragmentacji DNA za pomocą fal ultradźwiękowych, immunoprecypitacji oraz właściwej analizy mikromacierzowej. Na podstawie uzyskanych wyników stwierdzono, iż odpowiednia standaryzacja metody oceny metylacji DNA za pomocą mikromacierzy jest wymagana na każdym z kluczowych etapów prowadzonego eksperymentu. Wynika to z różnicy w dostępności i jakości uzyskanego materiału genetycznego zależnie od wykorzystywanej tkanki, różnej wrażliwości izolatów DNA na sonifikację oraz ze względu na warunki panujące w pracowniach i dostępność sprzętu laboratoryjnego. Nieoceniona jest również rola badacza, który każdorazowo powinien weryfikować poprawności przebiegu eksperymentu.

Methylation is an epigenetic modification of DNA widespread in mammalian genomes. The role of DNA methylation in genome functioning is to silence gene expression by modifying sites called CpG islands. The most important biological processes regulated by DNA methylation are: inactivation of the X chromosome, parental imprinting and cancer transformation. Many molecular biology techniques allow to assess the degree of DNA methylation, on the scale of the entire genome, as well as defined fragments within genes of interest. The aim of presented work was to perform optimization and shed the light on technical aspects of the analysis of mouse genome methylation by the use of micoraarray.Mice brain, lung and retinal tissues were used to demonstrate significant differences and technical difficulties at key stages of the experiment. Microarray analysis was standardized based on Agilent Technologies protocol guidelines „Agilent Microarray Analysis of Methylated DNA immunoprecipitation”. Particular attention was required for the stages of: DNA isolation, DNA fragmentation by means of ultrasonic waves, immunoprecipitation and direct microarray procedures.Obtained results demonstrated, that proper and individual standardization of assessment of DNA methylation by the use of microarray technology is essential at each stage of the experiment. The need for particular attention of the researcher is related with the differences in the availability and quality of the genetic material obtained from various tissues, differences in DNA sensitivity to sonication, as well as due to different experimental laboratory conditions, equipment and technical support. The role and experience of the researcher is also invaluable to ensure the proper performance of the entire microarray experiment and reliable final results.