Effect of BRAF kinase inhibitors on the level of RIPK4 protein in melanoma cells

Niskocząsteczkowe inhibitory zmutowanej kinazy BRAF (wemurafenib i dabrafenib) wykorzystuje się w terapii czerniaka złośliwego z mutacją V600EBRAF. Są to jednak leki na które komórki czerniaka się uodparniają, prowadząc do wznowy nowotworu. Stąd też bada się mechanizmy lekooporności i poszukuje się nowych celów molekularnych, które całkowicie zahamują rozwój czerniaka. Z uwagi na sugerowaną onkogenną funkcję kinazy RIPK4, której rola w czerniaku nie jest poznana oraz podobieństwo strukturalne białka BRAF i RIPK4, w niniejszej pracy przeanalizowano ekspresję genów białek BRAF, MAP2K1, RIPK4 oraz PEBP1 w komórkach czerniaka wykorzystując ogólnodostępne bazy mikromacierzowe GEO, porównano struktury domen kinazowych dzikiej i zmutowanej kinazy BRAF oraz białka RIPK4 za pomocą programu BLAST i PyMOL. Dodatkowo sprawdzono wpływ dabrafenibu i wemurafenibu na przeżywalność komórek czerniaka testem MTT oraz aktywność ERK1/2 i poziom kinazy RIPK4 za pomocą Western blot. W pracy potwierdzono wysoki stopień podobieństwa struktur BRAF i RIPK4 oraz wykazano, wyższy poziomu ekspresji białek szlaku MAPK i RIPK4 w komórkach melanomy względem prawidłowych melanocytów. Ponadto wykazano doświadczalnie, że zarówno wemurafenib jak i dabrafenib hamuje aktywność ERK1/2 i obniża poziom kinazy RIPK4, co koreluje ze spadkiem przeżywalności komórek czerniaka.

Small-molecular weight inhibitors of mutant BRAF kinase (vemurafenib and dabrafenib) are used for the treatment of malignant melanoma patients carrying V600EBRAF mutation. However, melanoma cells develops resistance for both drugs when used as monotherapy. Therefore mechanisms of drug resistance are being investigated and new molecular targets are studied being sought that will could completely inhibit the development of melanoma. Because of suggested oncogenic function of RIPK4 kinase, which role in melanoma remain unknown and its structural similarity with BRAF protein, in the present work the domains of wild and mutant BRAF kinase, and RIPK4 protein were compared using the BLAST and PyMOL programs. Furthermore, we analyzed relative expression of know genes such as MAP2K1, and PEBP1 in melanoma cells and compare with RIPK4 genes. The gene expression microarray data of melanoma were obtained from (NCBI) Gene Expression Omnibus and were accessible through Gene Expression Omnibus series accession number GDS1965, GDS429S and GSE31909 microarray bases. In addition, the effect of dabrafenib and vemurafenib on melanoma cell survival was tested by MTT. ERK1/2 activity and RIPK4 kinase levels were analyzed by Western blot technique. The results confirms the high degree of similarity of RIPK4 with BRAF structures and shows a higher level of expression of the MAPK pathway and RIPK4 proteins in melanoma cells compared to normal melanocytes. We demonstrated that both vemurafenib and dabrafenib inhibits ERK1/2 activity and reduce RIPK4 kinase level in melanoma cells in the time and dose-dependent way what correlates with a decrease of melanoma cell survival.