Role of MAPK and PI3K/AKT signaling pathways in the response of acute myeloid leukemia cells to venetoclax

Ostra białaczka szpikowa (AML) to nowotwór złośliwy układu krwiotwórczego, wywodzący się z mieloidalnej linii hematopoezy. Charakteryzuje się niekontrolowaną proliferacją oraz akumulacją niedojrzałych i nieprawidłowych blastów w szpiku kostnym i krwi obwodowej, co prowadzi do upośledzenia prawidłowej hematopoezy i niewydolności szpiku kostnego. Mimo postępów w zrozumieniu biologii AML, dostępne terapie są wciąż niewystarczające z powodu oporności komórek nowotworowych na leczenie. Jednym z istotnych mechanizmów umożliwiających przeżycie komórek białaczkowych jest nadmierna aktywacja szlaków sygnałowych: kinazy białkowej aktywowanej mitogenami (MAPK)/kinazy regulowanej sygnałem pozakomórkowym (ERK) i/lub fosfatydyloinozytolu 3(PI3K)/kinazy białkowej B (AKT). Szlaki te promują proliferację, hamują apoptozę oraz wspierają adaptację komórek nowotworowych do niekorzystnych warunków mikrośrodowiska. Dodatkowo, wysoka ekspresja białek anty-apoptotycznych, w szczególności białka BCL-2, wspiera przeżycie komórek AML. Wenetoklaks (ABT-199), selektywny inhibitor białka BCL-2, wykazuje obiecującą skuteczność w leczeniu AML, natomiast jego działanie może być ograniczone przez mechanizmy kompensacyjne, m.in aktywację szlaków przetrwania oraz ekspresję innych białek z rodziny BCL-2, np. MCL-1. Celem niniejszej pracy było określenie wpływu inhibitorów szlaków MAPK/ERK (PD98059) i PI3K/AKT (LY294002) na aktywność przeciwbiałaczkową wenetoklaksu w komórkach AML linii HL-60. W celu weryfikacji celu przeprowadzono analizę żywotności komórek metodą PrestoBlue w warunkach hodowli 2D i 3D. Ocenę proliferacji przeprowadzono na podstawie analizy liczebności komórek metodą Coultera, analizy cyklu komórkowego przy użyciu barwienia jodkiem propidyny, a także poprzez oznaczenie indeksu mitotycznego oraz odsetka komórek wykazujących cechy katastrofy mitotycznej. Indukcję apoptozy w komórkach oceniono za pomocą testu aneksyna V/jodek propidyny oraz mikroskopowej analizy morfologii komórek, umożliwiającej określenie indeksu apoptotycznego. Ekspresję białek BCL-2 i MCL-1 oceniono metodą Western Blot. Uzyskane wyniki wykazały, że skojarzenie wenetoklaksu z inhibitorami PD98059 lub LY294002 powodowało znaczne obniżenie żywotności komórek HL-60 w porównaniu do ich pojedynczego zastosowania, przy czym silniejszy efekt zaobserwowano w hodowli 2D niż 3D. Traktowanie komórek inhibitorami w skojarzeniu prowadziło również do wyraźnego wzrostu liczby komórek apoptotycznych oraz zatrzymania cyklu komórkowego w fazie G2/M. Dodatkowo w analizie mikroskopowej zaobserwowano cechy katastrofy mitotycznej, co może świadczyć o aktywacji w komórkach białaczkowych alternatywnego mechanizmu śmierci komórkowej. Ocena poziomu białek BCL-2 i MCL-1 wykazała, że inhibitory szlaków sygnałowych MAPK/ERK i PI3K/AKT stosowane samodzielnie zwiększały poziom białek anty-apoptotycznych, natomiast ich połączenie z ABT-199 skutkowało istotnym obniżeniem poziomu zarówno BCL-2, jak i MCL-1. Uzyskane wyniki wskazują, że jednoczesne blokowanie szlaków MAPK/ERK i PI3K/AKT w połączeniu z blokadą białka BCL-2 nasila efekt przeciwnowotworowy poprzez aktywację apoptozy, zatrzymanie cyklu komórkowego oraz zmniejszenie poziomu białek anty-apoptotycznych. Mniejsza skuteczność terapii w modelu 3D podkreśla znaczenie mikrośrodowiska komórkowego w modulowaniu odpowiedzi na leczenie i konieczność uwzględnienia jego zastosowania w badaniach przedklinicznych. Uzyskane wyniki wspierają koncepcję terapii skojarzonych, jako obiecującej strategii w walce z opornością komórek białaczkowych i stanowią podstawę do dalszych badań.

Acute myeloid leukemia (AML) is a malignant tumor of the hematopoietic system, originating from the myeloid lineage. It is characterized by uncontrolled proliferation and accumulation of immature and abnormal blasts in the bone marrow and peripheral blood, leading to impaired hematopoiesis and bone marrow failure. Despite advances in understanding the biology of AML, currently available therapies remain insufficient due to the development of resistance in leukemic cells. One of the key mechanisms promoting AML cell survival is the excessive activation of signaling pathways, particularly the mitogen-activated protein kinase (MAPK)/extracellular signal-regulated kinase (ERK) and/or phosphatidylinositol 3-kinase (PI3K)/protein kinase B (AKT) pathways. These cascades enhance proliferation, inhibit apoptosis, and support the adaptation of leukemic cells to adverse microenvironment conditions. Additionally, high expression of anti-apoptotic proteins, especially BCL-2, contributes to AML cell survival. Venetoclax (ABT-199), a selective BCL-2 inhibitor, has shown promising efficacy in AML treatment; however, it’s effectiveness may be limited by compensatory mechanisms, such as activation of parallel survival pathways and upregulation of the other BCL-2 family proteins, for example MCL-1. The aim of the study was to evaluate the effects of MAPK/ERK (PD98059) and PI3K/AKT (LY294002) pathway inhibitors on the antileukemic activity of venetoclax in the HL-60 AML cell line. To achieve this, cell viability was assessed using the PrestoBlue assay in both 2D and 3D cell culture conditions. Proliferation was evaluated based on cell counts using the Coulter method, cell cycle distribution assessed by propidium iodide staining, and calculation of the mitotic index and the proportion of cells exhibiting features of the mitotic catastrophe. Apoptosis was assessed using the annexin V/propidium iodide assay and morphological analysis of cells under light microscopy to calculate the apoptotic index. Expression levels of BCL-2 and MCL-1 proteins were determined by Western Blot technique. The results demonstrated that combining venetoclax with either PD98059 or LY294002 significantly decreased the viability of HL-60 cells in comparison to single-agent treatment, with a more pronounced effect observed in 2D than 3D cell culture model. Combination treatments also led to an increase in apoptotic cell numbers and arrest cell cycle in the G2/M phase. Additionally, microscopic analysis revealed features characteristic of mitotic catastrophe, suggesting the involvement of an alternative cell death mechanism. Analysis of BCL-2 and MCL-1 level showed that treatment with either pathway inhibitor alone increased anti-apoptotic protein levels, whereas combination with ABT-199 resulted in a marked reduction in the level of both proteins. These findings indicate that simultaneous inhibition of the MAPK/ERK and PI3K/AKT pathways, in conjunction with BCL-2 blockade, enhances the antileukemic effect by inducing apoptosis, causing cell cycle arrest, and reducing the level of anti-apoptotic proteins. The reduced efficacy observed in the 3D cell culture model highlights the importance of the tumor microenvironment in modulating treatment response and underscore the need to account for it in preclinical studies. These results support the rationale for combination therapies as a promising strategy to overcome drug resistance in AML and warrant further investigation.