The effect of the method of sampling on the detection of pathogenic fungi (Batrachochytrium sp.) in the skin of amphibians

Gromada płazów jest obecnie najbardziej zagrożoną grupą kręgowców na świecie. Spośród ponad 8000 gatunków aż 40% jest zagrożonych wyginięciem. Globalne zmiany klimatu, zanieczyszczenie i zanik środowisk wilgotnych i wodnych, czy pojawienie się gatunków inwazyjnych są czynnikami wpływającymi na tempo procesu wymierania. Jednym z lepiej poznanych czynników są patogeniczne skoczkowce (Chytridiomycota) atakujące płazy, takie jak Batrachochytrium dendrobatidis oraz B. salamandrivorans. Grzyby te, atakując skórę płazów bezogonowych oraz ogoniastych, powodują jej nadmierną keratynizację, co prowadzi do zaburzeń w gospodarce wodnej, procesu oddychania komórkowego oraz transportu elektrolitów. Powoduje to osłabienie danego osobnika, a po pewnym czasie prowadzi do jego śmierci. Chorobę powodowaną przez Batrachochytrium sp. nazwano chytridiomikozą. Jest ona globalnym problemem, pojawiającym się na wszystkich kontynentach, na których występują płazy. Z tego powodu istotny jest monitoring populacji płazów w miejscach, o niedostatecznym rozpoznaniu występowania patogenu, czyli między innymi na terenie Polski. W tym celu stosuje się izolację DNA grzybów z tkanki lub wymazu powierzchni skóry płaza. Celem pracy było porównanie metod pobierania próbki do izolacji oraz sprawdzenie nowych stanowisk na obecność Batrachochytrium sp.. Zebrano próbki od 89 osobników z 8 lokalizacji. Od 47 osobników pobrano zarówno próbkę tkanki (paliczek/koniec ogona) oraz wymaz z powierzchni skóry, a dla 42 osobników jedynie wymaz z powierzchni skóry. DNA patogenów izolowano za pomocą protokołów Qiagen lub z użyciem odczynnika Prepman, a następnie poddawano reakcji qPCR. Wyniki pokazały, że jedynie w przypadku 34% osobników wynik reakcji qPCR był jednoznacznie pozytywny lub negatywny. Dużym problemem było powstawanie niespecyficznych produktów w czasie reakcji co utrudniało rozpoznanie faktycznego stanu infekcji. Problem ten częściej dotyczył próbek izolowanych z wymazu skóry, niż z biopsji tkanki. Obecność Batrachochytrium dendrobatidis stwierdzono dla 12 osobników z 4 lokalizacji, natomiast obecność B. salamandrivorans stwierdzono dla 1 osobnika z 1 lokalizacji. Stwierdzenie to wymaga jednak potwierdzenia dalszymi badaniami.

The amphibian class is currently the most endangered group of vertebrates in the world. Of the more than 8,000 species, up to 40% are threatened with extinction. Global climate change, pollution and destruction of aquatic environments, or the emergence of invasive species are factors that influence the rate of the extinction process. One of the better-known factors are chytrid pathogens such as Batrachochytrym dendrobatodis and B.salamandrivorans. These fungi, by attacking the skin of amphibians, cause its excessive keratinization, which leads to disturbance of water management, breathing process and transport of electrolytes. This weakens the individual, and after some time leads to its death. The disease caused by Batrachochytrium sp. is called chytridiomycosis. It is a global problem that occurs on all continents with amphibian populations. For this reason, it is important to monitor the amphibian population in places where the occurrence of the pathogen is not well understood, including Poland. For this purpose, fungal DNA isolation from tissue or swab of the amphibian skin surface is used. The purpose of this work was to compare the sampling methods for isolation and to check new localities for the presence of Batrachochytrium sp..Samples from 89 individuals from 8 locations were collected. From 47 individuals, both the tissue sample (phalanx/tail tip) and the swab from the skin surface were collected, and for 42 individuals only the swab from the skin surface was taken. Pathogen DNA was isolated by Qiagen protocols or using Prepman reagent, followed by qPCR. The results showed that only in 34% of the result of qPCR reaction was unambiguously positive or negative. A big problem was the formation of non-specific products during the reaction, which made it difficult to recognize the actual state of infection. This problem was more common in samples isolated from skin swabs than from a tissue biopsy. The presence of B. dendrobatidis was found in 12 individuals from 4 locations, while the presence of B. salamandrivorans was found in 1 individual from 1 location. However, the occurrence of B. salamandrivorans requires additional confirmation.