Application of the Knoevenagel condensation reaction of aromatic dialdehydes with CH-acids in bioorthogonal chemistry

Rosnąca liczba przypadków zachorowań na nowotwory mobilizuje środowiska naukowe do tworzenia coraz lepszych możliwości terapeutycznych, a co za tym idzie opracowywania nowych bioaktywnych cząsteczek. Pomocnym narzędziem w śledzeniu losów leków, jego metabolitów lub jego interakcji z białkami może się okazać chemia bioortogonalna, opierająca się na zastąpieniu kolby reakcyjnej komórką eukariotyczną. Dziedzina ta wymusza szereg reguł istotnych do spełnienia dla stosowanych związków, aby były one biokompatybilne względem układu biologicznego. W tejże pracy skupiono się na możliwości zastosowania kondensacji Knoevenagla dialdehydów aromatycznych z CH-kwasami pod kątem zastosowania jej w bioznakowaniu inhibitora skierowanego na szlak PD-1/PD-L1 używając do tego celu modeli badawczych, którymi były linie komórkowe U-2 OS oraz Jurkat. Charakterystyczna fluorescencja pochodząca od związków biorących udział w reakcji kondensacji pozwoliła na weryfikację możliwości zachodzenia reakcji we wnętrzu komórki. Komórki poddawano inkubacji ze związkami, a następnie mierzono intensywność fluorescencji z użyciem cytometrii przepływowej. W toku pracy wykazano zachodzenie reakcji wewnątrz komórki, jednak proces tworzenia produktu był procesem konkurencyjnym do usuwania go na drodze biernej dyfuzji poza komórkę, co skutkowało ponownym spadkiem fluorescencji. Mimo to związki te sprzężone z innymi cząsteczkami mogą stanowić niezwykle istotne narzędzie do śledzenia molekuł wewnątrz komórki.

The increasing number of cancer cases mobilizes the scientific community to develop progressively better therapeutic options for this disease, and thus to develop new bioactive molecules. Bioorthogonal chemistry, based on replacing the reaction flask with a eukaryotic cell, may prove to be a helpful tool in tracking the pathway of drugs, their metabolites, or their interactions with proteins. This field imposes several important rules for the compounds that make them biocompatible with the biological system. The aim of this master thesis is focused on the possibility of using Knoevenagel condensation of aromatic dialdehydes with CH-acids in terms of its use in the biolabeling of an inhibitor directed at the PD-1/PD-L1 pathway using U-2 OS and Jurkat cell lines as models. The fluorescence characteristics for the substrate and products of the condensation reaction allowed monitoring of the reaction taking place inside the cell. The cells were incubated with the compounds and then the fluorescence intensity was measured using flow cytometry. During the experiments, it was proved that the reaction occurs inside the cell, but the product generation was competitive with its removal by passive diffusion outside the cell, which resulted in a decrease in fluorescence. Despite that, these compounds coupled with other molecules can be an extremely important tool for tracking molecules inside the cell.