The assessment of the cytotoxic effect of 2-hydroxy-4-metoxybenzophenone in cell cultures.

Benozfenon– 3 jest organicznym związkiem należącym do ketonów aromatycznych stosowanym jako filtr chemiczny absorbujący promieniowanie UV. Należy on do substancji promieniochronnych stosowanych w kosmetykach z pewnymi ograniczeniami. Jego dopuszczalne maksymalne stężenie zgodnie z wytycznymi FDA w Europie wynosi 10%. Wykazano, że BP-3 posiada wysoki poziom fotostabilbości. W przeciągu ostatnich lat przeprowadzono szereg badań dotyczących wchłaniania i mechanizmów działania benzofenonu-3. Wykazano, że benzofenon-3 po nałożeniu na skórę, jest wchłaniany do organizmu, po 1-2 godzinach od aplikacji wykrywalny jest we krwi, a wydalany jest z moczem i kałem, Ponadto w badaniach przeprowadzonych na szczurach wykazano, iż benzofenon-3 po podaniu doustnym kumuluje się w tkankach, jest wykrywalny głównie w wątrobie, nerkach i jądrach. Stwierdzono także zmiany w męskim układzie rozrodczym oraz zmniejszenie liczby plemników po podaniu doustnym tego związku. BP-3 wykazuje powinowactwo do receptorów hormonów steroidowych i dotychczasowe badania sugerują jego estrogenne i antyandrogenne działanie. Potwierdzone zostało również, że BP-3 jest najczęstszym fotoalergenem. Wyniki niektórych badań przeprowadzonych na zwierzętach wskazują na potencjalne, toksyczne działanie BP-3, jednak mechanizm działania i wpływ na funkcję poszczególnych narządów i tkanek nie został jeszcze określony. W badaniach in vitro wykazano, że BP-3 hamuje proliferację ludzkich keratynocytów, melanocytów i fibroblastów, natomiast bezpośrednie działanie cytotoksyczne tego związku nie było dotychczas badane. Dlatego, celem obecnych doświadczeń było określenie wpływu BP-3 na żywotność ludzkich fibroblastów skóry. Benzofenon-3 jest związkiem lipofilnym, wykazującym strukturalne podobieństwo do hormonów steroidowych, dlatego prawdopodobnie może kumulować się w tkance mózgowej, choć nie zostało to dotychczas potwierdzone. Z tego względu, drugim celem moich badań było ustalenie czy BP-3 uszkadza komórki neuronalne – SH-SY5Y. W przeprowadzonych badaniach oceniono wpływ 24-godzinnej hodowli komórek w obecności benzofenonu-3 w stężeniach 0,1; 1; 10 i 100 µg/ml. Żywotność komórek określano testem redukcji MTT, oceniającym aktywność enzymów mitochondrialnych w żywych komórkach. Proces nekrozy oceniano oznaczając aktywność dehydrogenazy mleczanowej uwolnionej z uszkodzonych komórek do pożywki hodowlanej. Redukcję MTT oceniano w dwóch niezależnych hodowlach fibroblastów i trzech różnych hodowlach komórek SH-SY5Y metodą spektrofotometryczną. Aktywność LDH oznaczano w dwóch odrębnych hodowlach fibroblastów i trzech niezależnych hodowlach komórek SH-SY5Y metodą spektrofotometryczną. Wykazano, że benzofenon-3 w stężeniu 100 ug/ml zwiększał aktywność dehydrogenazy mleczanowej w ludzkich fibroblastach skóry, natomiast w żadnym z badanych stężeń nie wpływał na aktywność enzymów mitochondrialnych. W komórkach SH-SY5Y BP-3 w stężeniach 10 i 100 µg/ml nasilał aktywność LDH a w stężeniu 100 µg/ml obniżał redukcję MTT. Uzyskane wyniki wskazują, że komórki SH-SY5Y są komórkami bardziej wrażliwymi od fibroblastów na działanie BP-3. Badania wykazały cytotoksyczne działanie BP-3, ale tylko przy zastosowaniu go w wyższych stężeniach (10 i 100 μg/ml). Poziomy BP-3 w skórze właściwej ani w tkance mózgowej nie były dotychczas oznaczane, ale wydaje się, że stężenia działające cytotoksycznie w obecnych badaniach in vitro są znacznie wyższe niż obecne w tkankach po naskórnej aplikacji preparatów zawierających ten związek. Nie można jednak wykluczyć, że długotrwała ekspozycja na BP-3 nie będzie indukować czy nasilać uszkodzeń komórek.

Benzophenone – 3 is an organic compound belonging to aromatic ketones used as a chemical filter absorbing the UV rays. It belongs to substances that protect from radiation, which are used in cosmetics with some restriction. Its maximum admissible concentration according to FDA guidelines is 10%. It has been demonstrated that BP-3 has a high level of photostability. During the past few years numerous studies were carried out concerning absorption and mechanisms of action of benzophenone-3. It has been shown that benzophenone-3 after the imposition on skin is absorbed into the organism, after 1-2 hours after application it is detectable in the blood, and it is excreted in urine and faeces. Moreover, in studies which were carried out on rats it has been demonstrated that benzophenone-3 after oral administration accumulates in tissues and it is detectable mainly in the liver, kidneys and nuclei. Changes in the male reproductive system and reduction in sperm count after the application of this medication have been also found. BP-3 presents affinity of steroid hormone receptors and the previous studies suggest its estrogenic and antiandrogenic activity. It has been also confirmed that BP-3 is the biggest fotoalergen. The results of some studies carried out on animals demonstrate a possible toxic activity of BP-3; however, its mechanism of action and its influence on the function of individual organs and tissues has not been determined yet. In in vitro studies in had been shown that BP-3 inhibits the proliferation of human keratinocytes, melanocytes and fibroblasts; however, the direct cytotoxic effect of this compound has not been studied yet. Hence, the aim of present studies was the specification of the influence of BP-3 on the lifespan of human skin fibroblasts. Benzophenone-3 is a lipophilic compound demonstrating the structural similarity to steroid hormones, which means that presumably it can accumulate in brain tissue; but is has not been proven. Thus, the second aim of my studies was establishing whether BP-3 damages neuronal cells – SH-SY5Y. In conducted studies the influence of 24-hours cell viability in the presence of benzophenone-3 in concentration of 0,1; 1; and 100 µg/ml was estimated. Cell viability was specified by means of MTT reduction test evaluating the activity of mitochondrial enzymes in living cells. Process of necrosis was evaluated via marking the activity of lactate dehydrogenase released from damaged cells into the culture medium. MTT reduction and LDH activity were evaluated in two independent fibroblast culture mediums and three different cell cultures SH-SY5Y by means of spectrophotometric method. It was demonstrated that benzophenone-3 in concentration of 100 µg/ml was increasing the activity of lactate dehydrogenase in human skin fibroblasts, whereas in none of the studied concentrations it did not have an influence on the activity of mitochondrial enzymes. In SH-SY5Y cells BP-3 in concentration of 10 and 100 µg/ml potentiated LDH activity in concentration of 100 µg/ml and lowered MTT reduction. Gathered results demonstrate that SH-SY5Y cells are more sensitive cells to BP-3 activity than fibroblasts. The studies have shown the cytotoxic effect of BP-3, but only when it has been used in higher concentrations (10 and 100 μg/ml). BP-3 levels in dermis or brain tissue have not been marked yet, but it seems that the concentrations cytotoxic active in recent in vitro studies are significantly higher than the ones present in tissues after epidermal application of the cream containing this compound. It cannot be excluded, however, that long lasting exposure to BP-3 will not induce or exacerbate cells’ damage.