Obtaining and characteristics of recombinant lysostaphins naturally produced by Staphylococcus simulans and Staphylococcus pseudintermedius

Lizostafina wytwarzana przez bakterie Staphylococcus simulans jest enzymem o działaniu antybakteryjnym, powszechnie wykorzystywanym w laboratoriach do degradacji ścian komórkowych gronkowców. Niedawno, w Zakładzie Biochemii Analitycznej została odkryta nowa lizostafina, produkowana przez S. pseudintermedius. Niniejsza praca skupia się na porównaniu wydajności oczyszczania obu białek i prezentuje różnice w ich aktywności. Produkcja lizostafiny S. simulans została przeprowadzona według wcześniej zoptymalizowanej procedury. Uzyskanie lizostafiny S. pseudintermedius wymagało optymalizacji warunków ekspresji i oczyszczania. Analizowano wpływ rodzaju stosownego podłoża, czasu i temperatury hodowli na wydajność produkcji białka w odniesieniu do ilości uzyskanego produktu we frakcji rozpuszczalnej. Sprawdzono również wpływ wartości OD600, przy którym dokonywano indukcji produkcji białka rekombinowanego. Analiza dwóch różnych metod oczyszczania białka wykazała, że sączenie molekularne było metodą nieefektywną ze względu na 35% spadek wydajności i prawie 2-krotne obniżenie aktywności. Aktywność i specyficzność lizostafin określano poprzez pomiar szybkości lizy komórek gronkowców inkubowanych z enzymem. Porównanie aktywności litycznej wobec czterech szczepów gronkowców, wykazało oporność szczepu S. Pseudintermedius 222 na produkowaną przez siebie lizostafinę.

Lysostaphin produced by S. simulans is an antimicrobial enzyme, commonly used in laboratories to degrade staphylococci cell walls. Recently, a new lysostaphin produced by S. pseudintermedius was discovered in the Department of Analytical Biochemistry. This research presents efficiency comparison of purification methods used to obtain both proteins and shows differences between their activity. Production of lysostaphin S. simulans was performed according to the optimised protocol. Obtaining purified lysostaphin S. pseudintermedius required optimising of expression and protein purification conditions. Influence of different media, culture timescale and temperature on the efficiency of protein expression with respect to the amount of product formed was analysed. The influence of OD600 value when induction was performed, was also tested. Analyse of two different purification methods shows, that molecular filtration was ineffective, because of 35% loss in efficiency and about 2-fold decrease of activity. Enzymes activity and specificity was determined by the measurement of a rate of staphylococcal cells lysis incubated with the enzymes. Comparison of activity against four different staphylococci strains, revealed resistance of S. pseudintermedius 222 on produced lysostaphin.