Dostarczanie klatki białkowej TRAP do komórek nowotworowych MCF-7 i HeLa

Obecnie powstaje wiele różnorodnych systemów dostarczania nanocząstek. Część nanocząstek ma za zadanie wniknąć do komórek i, zazwyczaj, uwolnić wewnątrz niej ładunek. Niestety, specyficzne szlaki komórkowe uruchamiane podczas internalizacji są rzadko badane. W rzeczywistości, definiowanie procesów, które mogłyby być potencjalnie kontrolowane poprzez stymulację lub hamowanie, jest bardzo pożyteczne. Wykazano już, że klatka TRAP – nanocząstka opracowywana w Laboratorium Bionanonauki i Biochemii w Małopolskim Centrum Biotechnologii – wnika do komórek i uwalnia ładunek białkowy w wyniku kontrolowanego rozpadu klatki. Do tej pory nie poznano jednak specyficznej ścieżki endocytozy tej klatki. Tą pracą wypełniamy lukę i przedstawiamy nasze wstępne badania internalizacji nowej wersji klatki TRAP zdolnej do przechowywania białka fluorescencyjnego mCherry i uwalniania go wewnątrz komórek MCF 7 i HeLa. Klatka została scharakteryzowana przy użyciu transmisyjnej mikroskopii elektronowej (ang. TEM) i natywnej elektroforezy w żelu poliakrylamidowym (ang. native PAGE). Internalizacja klatki TRAP została umożliwiona poprzez jej dekorację peptydami penetrującymi błonę komórkową PTD4 i peptydami HA/E2 wspomagającymi jej uwalnianie z endosomów. Przed rozpoczęciem badań nad pobieraniem klatek przez komórki sprawdzona została ich cytotoksyczność i stabilność w różnych środowiskach. Aby określić, które szlaki endocytozy są uruchamiane podczas pobierania klatek TRAP, komórki inkubowano z różnymi inhibitorami endocytozy. Pomimo złożoności naszych wyników, sugerujemy, że makropinocytoza może być najczęściej uruchamianą ścieżką. Praca ta jest elementem składowym szerszych badań nad klatkami TRAP, przypuszczalnie pozwalającym na zdefiniowanie dodatkowego sposobu kontroli dostarczania klatek.

Nowadays, a great variety of nanodelivery systems are being created. Part of the nanovehicles are designed to enter the cells and, usually, to release cargo inside the cell. Unfortunately, specific cellular pathways triggered during the uptake are less investigated. In fact, defining processes which could be potentially controlled by stimulation or inhibition is highly profitable. It was already shown that the TRAP cage – nanovehicle being developed in Bionanoscience and Biochemistry Laboratory in Malopolska Centre of Biotechnology – enters the cells and releases its protein cargo as a result of a triggerable cage disassembly. However, specific route of cage endocytosis had not been revealed to date. Here we fill the gap and demonstrate our early internalization studies of a novel TRAP cage version able to capture mCherry fluorescent protein and to release cargo inside MCF 7 and HeLa cells. To characterize the cage, transmission electron microscopy (TEM) and native polyacrylamide gel electrophoresis (native PAGE) were carried out. To enable TRAP cage internalization, TRAP-cage was decorated with cell penetrating PTD4 and endosomal escape HA/E2 peptides. To prepare TRAP cages to cell delivery studies, cage cytotoxicity and stability in different environments were checked. Finally, to define, which internalization routes are triggered during the TRAP cage uptake, cells were incubated with various endocytosis inhibitors. Despite the complexity of our findings, we suggest that macropinocytosis can be predominant in TRAP cage internalization. This work is a building block of a wider TRAP cage research, presumably allowing to define an additional way to control cage administration.