Modelowe badania in vitro oraz in vivo patogenności bakterii Porphyromonas gingivalis

Bibliogr. s. 142-162. Dostęp do publikacji jest możliwy w Archiwum UJ

Praca doktorska obejmuje badania patogenezy bakterii Porphyromonas gingivalis (Pg) - kluczowej bakterii w rozwoju dysbiotycznej, przewlekłej choroby zapalnej przyzębia potocznie zwanej, paradontozą (PD). Coraz więcej doniesień wskazuje, że patogen ten jest również powiązany z rozwojem poważnych chorób systemowych, takich jak choroby sercowo-naczyniowe. Mimo intensywnych badań, wciąż jednak niewiele wiadomo o mechanizmach będących podstawą tych powiązań. Istotne wydaje się przedostawanie się bakterii się z jamy ustnej do krwioobiegu, migracja przez naczynia krwionośne i zasiedlanie odległych tkanek. Z drugiej strony, zapaleniu dziąseł często towarzyszy napływ ruchliwych komórek żernych, w tym makrofagów, które mogą stanowić wehikuł dla Pg, jak to ma miejsce w przypadku innych patogenów wykorzystujących te komórki jak przysłowiowe konie trojańskie. Przyczyną chorobotwórczości Pg są liczne czynniki wirulencji. Do najważniejszych należą proteazy cysteinowe - gingipainy, wydzielane przez słabo poznany typ IX systemu sekrecji białek bakterii gramujemnych (T9SS). T9SS zbudowany jest z wielu komponent niezbędnych do translokacji przez błonę zewnętrzną białek posiadających konserwatywną domenę C-terminalną (ang. C-terminal domain, CTD), w tym gingipain. Nasza wiedza o roli, jaką pełnią komponenty składowe T9SS w wirulencji Pg jest niewielka. Wydaje się jednak, że przynajmniej białka powierzchniowe T9SS mogą pełnić inne ważne, bezpośrednie funkcje w oddziaływaniu z komórkami gospodarza. Głównym celem pracy było zbadanie wpływu Pg na rozwój chorób systemowych, poprzez oddziaływanie bakterii z śródbłonkiem naczyń krwionośnych i komórkami fagocytarnymi gospodarza. Analizie poddana została również rola składników systemu T9SS w patologicznym oddziaływaniu bakterii z komórkami gospodarza. Wykorzystano zarówno organizmy modelowe (badania in vivo), jak i modele komórkowe (badania in vitro). W pracy doktorskiej, we współpracy z University of Sheffield, po raz pierwszy wykorzystano model danio pręgowanego (Danio rerio), powszechnie stosowanego do badania patogenności ludzkich bakterii. Organizm ten został wykorzystany do zbadania patogenności Pg i procesu rozsiewania się bakterii. Ze względu na przezroczystość zarodków oraz arsenał dostępnych linii transgenicznych, proces ten był obserwowany w czasie rzeczywistym infekcji, przy wykorzystaniu zaawansowanej technologii mikroskopii 3D. W badaniach in vitro natomiast wykorzystano mysie makrofagi oraz ludzkie komórki śródbłonkowe. Wykazano odmienny potencjał patogenny różnych szczepów Pg oraz kluczową rolę gingipain w wirulencji bakterii na modelu D. rerio. Ponadto przy użyciu linii transgenicznych (ekspresja białek fluorescencji w śródbłonku) pierwszy raz zaobserwowano, że Pg jest w stanie pokonać barierę naczyń krwionośnych, a proces ten jest zależny od gingipain. Zaobserwowano także zdolność bakterii do adhezji do komórek śródbłonka gospodarza oraz ich silną interakcje z wsierdziem (ang. endocardium). Kolejne badania przy użyciu ludzkich pierwotnych komórek śródbłonka potwierdziły zależną od gingipain zdolność bakterii do inwazji tych komórek. Badania in vivo oraz in vitro wykazały zdolność Pg do uszkodzenia bariery śródbłonka i degradację międzykomórkowych białek adhezyjnych, jako potencjalny mechanizm parakomórkowego rozprzestrzeniania się bakterii. Druga część badań dotyczyła oddziaływania Pg z komórkami fagocytarnymi. Przy wykorzystaniu linii mysich makrofagów wykazano zdolność dzikiego szczepu Pg do przeżycia wewnątrz komórek. W porównaniu do szczepu rodzicielskiego Pg, przeżywanie mutantów pozbawionych poszczególnych składników T9SS w makrofagach było znacznie upośledzone. Co ciekawe zaobserwowano największą podatność na eliminacje mutanta Δsov. Wykazano też, że Δsov wybarwione barwnikiem fluorescencyjnym „świecącym” w niskim pH, znacznie częściej trafiały do zakwaszonych przedziałów komórkowych, prawdopodobnie do fagolizosomów, co może świadczyć o antyfagocytarnych właściwościach białka Sov. Badania te potwierdzono na modelu D. rerio, gdzie w przeciwieństwie do Δsov, szczep dziki hamował aktywność bakteriobójczą komórek gospodarza. Ponadto wykorzystując linie transgeniczne D. rerio. (fluorescencja fagocytów), zaobserwowano pierwszy raz w czasie rzeczywistym infekcji zdolność fagocytów do pochłaniania Pg oraz migrację komórek po organizmie gospodarza. Wyniki tych pionierskich doświadczeń wykazały duże możliwości zastosowania modelu danio pręgowanego do badania chorób systemowych powodowanych przez Pg. Ponadto wykazano, że składniki T9SS mogą funkcjonować jako osobne czynniki wirulencji Pg chroniąc bakterie przed fagocytozą i wewnątrzkomórkową eliminacją. Identyfikacja roli czynników wirulencji istotnych dla rozprzestrzenianiu się Pg w organizmie gospodarza może posłużyć do opracowania ukierunkowanych strategii zapobiegających chorobom systemowym powiązanym z paradontozą. Badania przeprowadzone tej pracy doktorskiej zostały częściowo wykonane w ramach programów Etiuda oraz Erasmus Plus.

In this PhD, the pathogenesis of Porphyromonas gingivalis (Pg) was studied. Pg is a keystone pathogen involved in the development of a dysbiotic, chronic inflammatory disease, periodontitis (PD). There is, however, increasing evidence to suggest that Pg influences the progression of chronic systemic conditions such as cardiovascular diseases. Data shows that Pg can enter the bloodstream during dental procedures or via inflamed periodontal tissue and spread systematically. In addition, tissue homing phagocytes might serve as a reservoir for intracellularly persistent Pg, thus acting as a "Trojan horse" in bacterial dissemination. Pg produces many virulence factors that lead to high pathogenic potential. The cysteine protease, gingipains, are the main virulence factors that are secreted through unique and yet poorly characterized type IX secretion system (T9SS). The T9SS is composed of many components that allow protein cargoes, which bear a conserved C-terminal domain, such as gingipains, to be translocated through the outer membrane. However, little is known about the specific functions of these components. It is plausible that at least surface components of T9SS might exhibit additional direct roles in interactions with the host cells. The main aim of this PhD was to establish a novel zebrafish (Danio rerio) embryo model to study and visualise Pg-mediated systemic diseases, particularly bacterial interactions with the endothelium and phagocytic cells. In addition, the functions of T9SS components, especially Sov proteins, in pathogenic interactions between bacteria and the host phagocytic cells were investigated. The zebrafish in vivo infection model alongside monolayers of human endothelial cells and murine macrophages were employed to investigate the mechanism of Pg systemic dissemination and interaction with host cells. Through a combination of zebrafish transparency, numerous transgenic lines, and advanced 3D live microscopy, it was possible to perform real-time experiments to visualise and dissect host pathogen interactions. Using zebrafish as a model, the different pathogenic potentials of various Pg strains and the critical functions of gingipains has been demonstrated. Moreover, by using transgenic embryos that express fluorescence in the endothelium, for the very first time it was possible to show in real-time the ability of Pg to traverse the vascular barrier in a gingipain-dependent manner. In addition, bacteria preferentially adhered to and interacted with the endocardium, possibly leading to increased permeability, vascular injury and heart abnormalities. The next line of experiments that were performed in parallel on human primary endothelial cells confirmed a gingipain-dependent invasion of Pg. Both in vitro and in vivo studies showed the ability of Pg to increase vascular permeability and indicate that the gingipains-mediated degradation of crucial junctional protein as a potential mechanism of bacterial dissemination through loosened intercellular gaps. In the second part of this study, interaction of Pg with the phagocytic cells was investigated. Wild-type Pg were able to survive intracellularly in murine macrophages causing decreased systemic immune cell clearance, in contrast to T9SS mutants that were eradicated faster. Interestingly, the Δsov mutant showed the highest interaction with murine macrophages with much faster clearance. Further studies revealed that Δsov fluorescently labelled with a pH sensitive dye, rapidly and predominantly were localised within acidic cellular environments, most likely phagolysosomes. This is suggestive of antiphagocytic properties of the Sov protein. These results were reproduced using the zebrafish embryo infection model. Moreover, using transgenic zebrafish lines fluorescently tagged for macrophages, it was possible to visualise, for the first time, the ability of phagocytes to engulf Pg and migrate to distant sites in the organism. The results presented in this PhD thesis showed for the first time the possibility of using zebrafish embryos as a model to study Pg-mediated systemic diseases. Moreover, this study supports the concept that Pg may be a significant contributor for initiating oral microberelated cardiovascular damage leading to long-term systemic diseases. Furthermore, this study revealed that components of the T9SS Pg secretion apparatus may work as independent virulence factors, protecting bacteria from phagocytosis, and intracellular elimination. Identifying important roles of these components in the Pg-mediated pathogenesis may help develop targeted therapies against systemic diseases associated with periodontitis.