Optimization of transfection and BMP-2 stimulation of human adipose stem cells

Obecnie komórki macierzyste są głównym obiektem zainteresowań badaczy zajmujących się inżynierią tkankową. Komórki macierzyste mają możliwość różnicowania się w różne linie komórkowe oraz wykazują praktycznie nieograniczoną liczbę podziałów. Tłuszczowe komórki macierzyste mogą znaleźć zastosowanie w leczeniu defektów tkanki kostnej, zastępując komórki macierzyste szpiku kostnego. W 2001 roku Zuk i wsp. opisali macierzyste komórki pochodzenia tłuszczowego (ADSCs) o zdolności do różnicowania między innymi w osteoblasty. Pobranie mezenchymalnych komórek macierzystych od pacjentów jest związane z mniejszymi ubocznymi efektami poboru i z większą ilością uzyskanych komórek macierzystych w przypadku tłuszczowych komórek macierzystych, aniżeli komórek macierzystych szpiku kostnego. Białko morfogenetyczne kości (BMP-2) jest znanym induktorem osteogenezy. W tej pracy został zbadany wpływ BMP-2 na linię unieśmiertelnionych ludzkich tłuszczowych komórek macierzystych (ASC52telo) w połączeniu z różnymi czynnikami osteogennymi. W tym celu zastosowano testy MTS i ALP do określenia aktywności alkalicznej fosfatazy w komórkach, której podwyższenie świadczy o ich różnicowaniu w osteoblasty. Wyniki pokazały, że BMP-2 produkowane w komórkach E.Coli w połączeniu z askorbinianem i deksametazonem mają porównywalny wpływ na tłuszczowe komórki macierzyste z zastosowaniem askorbianianu i deksametazonu na komórki. Jedynie BMP-2 produkowane w komórkach CHO wraz z askorbinianem i deksametazonem wpłynęło zasadniczo lepiej na zwiększenie aktywności alkalicznej fosfatazy w komórkach niż stymulacja askorbinianem i deksametazonem. Próby transfekowania ASC52telo wektorem phMGFP przy użyciu odczynników Lipofectamine 3000 i Lipofectamine Stem Transfection Reagent wykazały niektóre komórki ekspresjonujące GFP, ale wydajność transfekcji była bardzo niska. Przeciwnie komórki osteoblastów mysich transfekowane tą samą metodą wykazały wysoką ekspresję GFP. Dalsze badania skupią się między innymi na strategiach zmierzających do zwiększenia odpowiedzi na BMP-2 komórek ASC52telo.

Nowadays stem cells are the main object of interest for many researchers from tissue engineering field. Stem cells have the ability of differentiation in multiple lineages of cells and unlimited number of divisions. Application in the treatment of bone defects may apply adipose derived-stem cells (ADSCs) instead of bone marrow stem cells (BMSCs). In 2001 Zuk et al. described adipose-derived stem cells which could differentiate for example in osteoblasts. Harvesting mesenchymal stem cells from patients is associated with less morbidity and the higher amount of received stem cells in case of collection ADSCs than BMSCs. Bone morphogenetic protein (BMP-2) is known inductor of the osteogenesis. In this study we have investigated the response of hTERT immortalized human adipose stem cells (ASC52telo) to rhBMP-2 in the presence of the different osteogenic factors. For this purpose MTS and ALP assays were carried out for evaluation of early osteogenic event in cells. We show that BMP-2 produced in E.Coli with ascorbic acid and dexamethasone has the same effect on ASCs as application of merely ascorbic acid and dexamethasone combination. However, BMP-2 produced in CHO along with ascorbic acid and dexamethasone has a substantially better effect on increasing alkaline phosphatase activity than stimulation with ascorbic acid and dexamethasone. Our attempts to transfect ASC52telo with phMGFP vector using Lipofectamine 3000 or Lipofectamine Stem Transfection Reagent showed some cells expressing GFP, but the efficiency of transfection was extremely low. On the contrary, mouse osteoblast cells transfected with the same method showed high expression of GFP. Further studies will focus, inter alia, on strategies heading to enhanced BMP-response of ASC52telo.