In vitro cultures of Melittis Melissophyllum L. as a source of secondary metabolites of medicinal relevance

Miodownik melisowaty – Melittis melissophyllum L. jest przedstawicielem rodziny Lamiaceae. Gatunek zawiera metabolity wtórne o zróżnicowanej aktywności biologicznej, takie jak np. irydoidy, kwasy fenolowe, flawonoidy, polisacharydy, olejek eteryczny.Celem niniejszej pracy było prowadzenie wytrząsanych kultur pędowych miodownika melisowatego na dwóch wariantach podłoża Murashige’a i Skoog (MS): wariant A z dodatkiem: BAP – 1 mg/l, NAA – 0,5 mg/l, GA3 – 0,25 mg/l oraz wariant B z dodatkiem: BAP – 1 mg/l, NAA – 1 mg/l. Dla obu wariantów badano wpływ modyfikacji zawartości fosforanów w standardowym podłożu MS oraz wpływ suplementacji różnymi stężeniami prekursora (L-fenyloalaniny) na akumulację metabolitów wtórnych kwasów fenolowych i flawonoidów. Porównano również wpływ rozpuszczalnika (metanolu lub etanolu) na ekstrakcję metabolitów wtórnych. Po zakończeniu hodowli doświadczalnej biomasa została zebrana, wysuszona, zważona i sproszkowana. Następnie przygotowano wyciągi metanolowe i etanolowe oraz wykonano analizę jakościową i ilościową metodą HPLC kwasów fenolowych i flawonoidów. W sporządzonych wyciągach stwierdzono obecność 8 kwasów fenolowych (kwas protokatechowy, chlorogenowy, wanilinowy, p-kumarowy, ferulowy, m-kumarowy, o-kumarowy, rozmarynowy) i 4 flawonoidów (cynarozyd, rutozyd, kwercytryna, apigenina).Najkorzystniejszym podłożem produkcyjnym dla większości badanych kwasów fenolowych i flawonoidów okazał się wariant B(2P): (MS BAP – 1 mg/l, NAA – 1 mg/l, podwojona ilość fosforanów). Dodatek prekursora (L-fenyloalaniny) o końcowym stężeniu w pożywce 15mM okazał się najkorzystniejszy dla akumulacji metabolitów wtórnych. Znacząco zwiększyła się akumulacja badanych związków. Pod względem ilościowym dominującymi związkami były: kwas chlorogenowy (maksymalnie 2167,47 mg/100 g s.m), o-kumarowy (maksymalnie 438,52 mg/100 g s.m), p-kumarowy (maksymalnie 125,42 mg/100 g s.m) oraz cynarozyd (maksymalnie 1267,97 mg/100 g s.m). Metanol okazał się lepszym rozpuszczalnikiem do ekstrakcji badanych związków biomasy. Suma zawartości kwasów fenolowych i flawonoidów w wytrząsanych kulturach pędowych miodownika melisowatego wynosiła odpowiednio 2637,57 i 2130,71 mg/ 100 g s.m. Uzyskane ilości metabolitów wtórnych wielokrotnie przewyższały ich zawartości w roślinie gruntowej. Wytrząsane kultury pędowe Melittis melissophyllum L. potencjalnie mogą być bogatym źródłem metabolitów wtórnych o działaniu leczniczym.

Bastard balm - Melittis melissophyllum L. is a representative of the Lamiaceae family. The species contains secondary metabolites with diverse biological activities, such as iridoids, phenolic acids, flavonoids, polysaccharides, and essential oil.The aim of the present study was to run shoot cultures of Melittis melissophylum L. on two variants of Murashige and Skoog (MS) medium: variant A with the addition of: BAP - 1 mg/l, NAA - 0.5 mg/l, GA3 – 0,25 mg/l and variant B with the addition of: BAP – 1 mg/l, NAA – 1 mg/l. For both variants, the effect of modifying the phosphate content of the standard MS medium and the effect of supplementation with different concentrations of the precursor (L-phenylalanine) on the accumulation of secondary metabolites of phenolic acids and flavonoids were studied. The effect of solvent (methanol or ethanol) on the extraction of secondary metabolites was also compared. After completion of the experimental culture, the biomass was harvested, dried, weighed and powdered. Methanolic and ethanolic extracts were then prepared and qualitative and quantitative analysis of phenolic acids and flavonoids was performed by HPLC. Eight phenolic acids (protocatechuic acid, chlorogenic acid, vanillic acid, p-coumaric acid, ferulic acid, m-coumaric acid, o-coumaric acid, rosemary acid) and four flavonoids (cynaroside, rutoside, quercitrin, apigenin) were found in the prepared extracts.The B(2P) variant proved to be the most favorable production medium for most of the phenolic acids and flavonoids tested: (MS BAP - 1mg/l, NAA - 1mg/l, doubled phosphate). The addition of precursor (L-phenylalanine) with a final concentration in the medium of 15mM proved to be most beneficial for the accumulation of secondary metabolites. The accumulation of the studied compounds increased significantly. In terms of quantity, chlorogenic acid (maximum 2167.47 mg/100 g d.m.), o-coumaric acid (maximum 438.52 mg/100 g d.m.), p-coumaric acid (maximum 125.42 mg/100 g d.m.) and cynaroside (maximum 1267.97 mg/100 g d.m.) were the dominant compounds. Methanol proved to be a better solvent for extraction of the studied biomass compounds. The sum content of phenolic acids and flavonoids in the shoot cultures of Melittis melisophyllum L. was 2637.57 and 2130.71 mg/ 100 g d.m. The obtained amounts of secondary metabolites were many times higher than their contents in the ground plant. The shoot cultures of Melittis melissophyllum L. could potentially be a rich source of secondary metabolites with therapeutic activity.