Optimization of the NT2 cells imaging protocol for proteomic analysis of nuclear proteins

Jądro komórkowe jest wysoce dynamicznym organellum komórkowym. Odpowiada ono za kluczowe procesy mechanizmu i regulacji komórki. Do jego funkcji należy nie tylko przechowywanie informacji genetycznej, ekspresja genów czy „splicing” RNA, ale wiele innych procesów biologicznych.Około 20% zwierzęcego proteomu stanowią białka jądrowe. W badaniach proteomicznych są one zazwyczaj maskowane przez liczne enzymy metaboliczne i białka strukturalne. Najbardziej interesujące białka regulatorowe są najmniej licznymi białkami u eukariontów i przez to znajdują się często poniżej limitu detekcji. Frakcjonowanie pozwala zredukować złożoność ekstraktów tkankowych i tym samym umożliwia identyfikowanie i ewentualną analizę ilościową białek jądrowych. Eksperymenty tego typu nie są łatwe, gdyż warunkiem jest uzyskanie frakcji jąder o wysokiej czystości. Wybór właściwej procedury izolacji jąder komórkowych i następnie oczyszczenia białek jądrowych decyduje o powodzeniu takiego eksperymentu.W niniejszej pracy przeprowadzono procedurę izolacji jąder komórek NT2 oraz wykonano izolację białek z jąder komórkowych.Ważnym etapem procedury izolacji białek jądrowych było obrazowanie jąder. Miało ono na celu ocenę jakości preparatu, czyli czystości i integralność otrzymanych jąder. Do barwienia otrzymanych preparatów użyto dwóch typów barwników o odmiennej charakterystyce. Były nimi DAPI i Hoechst oraz błękit trypanu. Po analizie mikroskopowej stwierdzono, iż uzyskano satysfakcjonujące preparaty jądrowe, co wskazywało na odpowiednio przeprowadzoną procedurę izolacji oraz zapewnienie prawidłowych warunków. Zauważono, iż w preparacie uzyskanym z 20 milinów komórek liczba jąder jest nieproporcjonalnie mniejsza niż w przypadku użycia 30 milionów komórek. Przyczyną tego mogło być nieidentyczne rozpipetowanie jąder przed nałożeniem na szkiełko.

The cell nucleus is a highly dynamic cell organelle. It is responsible for the crucial processes of cell mechanism and regulation. Its functions include not only the storage of genetic information, gene expression or RNA splicing, but many other biological processes.About 20% of the animal proteome is nuclear proteins. However, they are usually masked by numerous metabolic enzymes and structural proteins. The most interesting regulatory proteins are the least numerous in eukaryotes and thus are often below the detection limit.Fractionation allows to reduce the complexity of tissue extracts and enables the identification and analysis of nuclear proteins. Experiments of this type are not easy, because the main requirement is to obtain a high purity nucleus fraction. Choosing of the proper procedure for the isolation of cell nuclei and purification of nuclear proteins determines the reliability of obtained results.In this work the isolation of NT2 cell nuclei and extraction of proteins from cell nuclei was performed.An important stage in the procedure of nuclear protein isolation was the imaging of nuclei. It aimed to assess the quality of the preparation, the purity and integrity of the obtained nuclei. In this work were used two types of dyes with different characteristics: DAPI, Hoechst and trypan blue.After microscopic analysis it was found that satisfactory nuclear preparations were obtained, which indicated a properly conducted isolation procedure. It has been noticed that 20 million cells give disproportionately smaller number of nuclei than when using 30 million cells.