Attempts to detect LC3 protein in Eisenia andrei earthworm coelomocytes

Autofagia, która jest ważnym procesem biorącym udział w przetrwaniu okresów niedoboru składników odżywczych oraz w recyklingu organelli komórkowych, jest coraz szerzej badanym zagadnieniem, ze względu na odkrycie jej funkcji w wielu istotnych procesach (np. w okresie neonatalnym ssaków) oraz udziału w chorobach (np. neurodegeneracyjnych). Jednym z najważniejszych markerów autofagii jest białko LC3. Przemiany i translokacje LC3 są podstawą większości metod wykrywania tego procesu. Jedną z najbardziej znanych jest badanie różnych postaci białka LC3 - LC3-I i LC3-II metodą Western Blot. Badania nad autofagią prowadzone są głównie na kręgowcach, w mniejszej skali również na bezkręgowcach, na takich gatunkach jak Drosophila melanogaster, czy Caenorhabditis elegans. Natomiast brak jest badań dotyczących autofagii w komórkach immunokompetentnych bezkręgowców. Niniejsza praca skupiła się na próbie wykrycia autofagii i detekcji białka LC3 w celomocytach dżdżownic Eisenia andrei. Proces autofagii indukowano za pomocą estru forbolu, rapamycyny, natomiast inhibitory takie jak, cytochalazyna D i wortmanina posłużyły do hamowania autofagii. Najsilniejszy efekt zaobserwowano w przypadku rapamycyny i estru forbolu (induktory) oraz cytochalazyny D (inhibitor). Do detekcji LC3 wykorzystano metody Western Blot oraz immunocytochemię. W wyniku analiz przy użyciu metody Western Blot nie wykazano białka LC3, ani jego różnych postaci. Natomiast metoda immunocytochemii pozwoliła wykazać obecność białka LC3 w celomocytach oraz jego zmiany w lokalizacji w obrębie komórki podczas inkubacji in vitro z cytochalazyną D, estrem forbolu oraz rapamycyną.Niniejsze badania wykazały, że detekcja białka LC3 metodą Western Blot w celomocytach E. anderi wymaga dalszego udoskonalania. Jednakże wyniki uzyskane dzięki immunocytochemii stanowią podwaliny oraz zachęcają do dalszych badań nad autofagią w komórkach immunokompetentnych dżdżownic.

Autophagy, which is important process for surviving periods of nutrient deficiency and in the recycling of cell organelles, is more and more widely studied issue, due to the discovery of its function in many important processes (e.g. in the neonatal period of mammals) and participation in diseases (e.g. neurodegenerative diseases). One of the most important autophagy marker is the LC3 protein. LC3 transformation and translocation are the most basic methods for detecting of this process. One of the best known methods for detecting of the autophagy is the study of various forms of LC3 – LC3-I and LC3-II proteins by Western Blot. Research on autophagy is mainly being performed on vertebrates, but also to a lesser extent on invertebrate, like Drosophila melanogaster or Caenorhabditis elegans. However, there is no research on autophagy in immunocompetent invertebrate cells. This work focused on the detection of autophagy by study of the LC3 protein and its forms in Eisenia andrei earthworm coelomocytes. The autophagy was induced by phorbol ester and rapamycin or was inhibited by the use of inhibitors like cytochalasin D and wortmannin. The strongest effect of the autophagy effect was observed in case of rapamycin and phorbol (inductors) and cytochalasin D (inhibitor). Western Blot and immunocytochemistry were used to detect LC3. As a result of the Western Blot analysis, LC3 protein and its forms were not found. However, immunocytochemical method showed the presence of LC3 in coelomocytes and demonstrated that the location of this protein changed in cell during in vitro incubation with cytochalasin D, phorbol ester and rapamycin.This study showed, that the detection of LC3 protein by Western Blot method in coelomocytes E. andrei must be improved. However results obtained with immunocytochemistry are the basics and encourage to further research on autophagy in immnunocompetent earthworm cells.