Microperoxidase-11 as a catalyst for glutathione S-nitrosylation

Mechanizmy sygnalizacyjne w których udział bierze cząsteczka tlenku azotu(II) (NO) mają duże znaczenie w układach biologicznych. Bezpośrednim sposobem przekazu sygnału przez NO jest aktywacja cyklazy guanylowej (sGC), odbywająca się poprzez skoordynowanie NO do żelaza hemowego, któremu towarzyszy konwersja GTP do cGMP. Jednakże równie istotnym sposobem przekazu sygnału jest S-nitrozylacja uznawana za modyfikację o charakterze sygnałowym, wpływająca na strukturę i funkcję wielu białek, regulując m.in kanały wapniowe oraz czynniki transkrypcyjne. Proponowanych jest wiele ścieżek opisujących sposób w jaki może dochodzić do powstawania S-nitrozotioli, jednak biologiczne znaczenie wielu z nich pozostaje kwestią sporną. W ostatnich latach obserwuje się wzrost zainteresowania rolą metaloprotein, których udział może zapewnić odpowiednie wymagania redoksowe potrzebne do syntezy RSNO. Proponuje się, że jednym z mechanizmów generowania S-nitrozotioli in vivo może być proces kowalencyjnego przyłączenia NO do ugrupowań -SH w obecności cząsteczki zdolnej do przyjęcia elektronu z NO bądź z tiolu. Celem pracy było sprawdzenie, czy mikroperoksydaza-11 (MP-11) jest dobrym katalizatorem w procesie generowania S-nitrozoglutationu (GSNO) w reakcji tlenku azotu(II) z glutationem (GSH) w warunkach beztlenowych. W tym celu zbadano dwie alternatywne ścieżki generowania GSNO, opierające się na przeniesieniu elektronu albo z NO (ścieżka pierwsza) albo z GSH (ścieżka druga) na Fe(III) znajdujące się w centrum hemowym, generując w pierwszym etapie odpowiednio kompleksy (MP)-Fe(II)-NO(+) lub rodnik (MP)-Fe(II)-GS. Kompleksy przejściowe reagując odpowiednio z GSH i NO, prowadziły do powstania formy przejściowej (MP)-Fe(II)-GSNO, która w kolejnym kroku uwalniała GSNO. Przeprowadzone badania wykazały, że w układzie dochodzi do generowania GSNO z udziałem hemowego centrum MP-11. Wykazano również, że badane ścieżki reakcji mają charakter stechiometryczny, a nie katalityczny. W niniejszej pracy wykorzystano dwie metody do oznaczania S-nitrozoglutationu (spektrofluorymetryczną oraz elektrochemiczną z użyciem sensora amiNO-700 czułego na stężenie NO). Odpowiedni dobór warunków pomiarowych umożliwił zarówno jakościowe jak i ilościowe oznaczenie wygenerowanego GSNO, jak również określenie wydajności tego procesu w zależności od stężenia NO i GSH. Ponadto, wykonano analizę spektrofotometryczną form przejściowych mikroperoksydazy-11 powstałych podczas przeprowadzonej reakcji, zbadano kinetykę reakcji i wyznaczono stałe szybkości reakcji zachodzących na żelazowym centrum MP-11 przy wykorzystaniu techniki zatrzymanego przepływu (ang. stopped-flow).

Signaling mechanisms mediated by nitric oxide (NO) show high importance in biological systems. One of the processes with direct signal transduction through NO is the activation of guanylyl cyclase (sGC) through coordinating NO to heme iron accompanied by conversion of GTP to cGMP. However, equally important is the process of S-nitrosylation, considered as a modification with signaling character, which affects structures and functions of many proteins and in consequence regulate calcium channels or transcription factors. Although, there are a few pathways of S-nitrosothiols formation in biological systems which are postulated, their biological relevance remains a contentious issue. In recent years there is a rise in the interest aimed at the role of metalloprotein, that can be responsible for meeting redox requirements necessary for S-nitrosothiol synthesis. One of the proposed mechanisms for generating S-nitrosothiols in vivo is the covalent binding of nitric oxide to -SH groups in thiols, in the presence of a molecule that is able to accept an electron from either NO or the thiol. The purpose of this work was to check if microperoxidase-11 (MP-11) will be an efficient catalyst of S-nitrosogluthatione (GSNO) formation in the reaction of nitric oxide (NO) with gluthatione (GSH) under anaerobic conditions. Experiments were conducted in two alternate pathways through charge-transfer complexes with NO (first pathway) or GSH (second pathway) to form (MP)-Fe(II)-NO(+) and radical (MP)-Fe(II)-GS respectively. Subsequently, these complexes reacted respectively with GSH and NO and led to formation of the intermediate complex – (MP)-Fe(II)-GSNO that subsequently released GSNO. The study confirmed that the MP-11 based system leads to GSNO generation. It was also shown that the studied reaction pathways have a stechiometric and not catalytic character. In this work, two methods were applied for the determination of S-nitrosogluthatione (spectrofluorimetric and an electrochemical method using an NO sensitive amiNO-700 sensor). Proper selection of measurement conditions allowed for both qualitative and quantitative determination of GSNO and also yield determination as a function of NO and GSH concentration. Moreover, spectroscopic analysis of microperoxidase-11 intermediate forms generated during the reaction was performed. Kinetics and reaction rate constants of reactions occurring at the iron center of MP-11 were determined using the stopped-flow technique.