Analysis of cytotoxic effect of SipB overexpressed by Salmonella Typhimurium on infected monocyte-macrophage cell line RAW264.7

SipB (ang. Salmonella Invasion Protein B) jest jednym z białek trzeciego system sekrecji T3SS (ang. Type III Secretion System) uczestniczącego w zakażaniu komórek eukariotycznych przez bakterię Salmonella. Po zakażeniu makrofagów pełni funkcję białka efektorowego odpowiedzialnego za aktywację kaspazy-1 uczestniczącej w dojrzewaniu IL-1β i IL-18. SipB może być także zaangażowany w wywoływanie śmierci zakażonych komórek. W naszym zespole postawiliśmy hipotezę, że nadekspresja białka SipB w bakteriach S. Typhimurium wzmocniłaby przeciwnowotworową aktywność tej bakterii. Jednym z mechanizmów mogłoby być wzmożenie śmierci komórek makrofagowych podtrzymujących środowisko immunosupresyjne nowotworu. Celem mojej pracy było zbadanie efektów bakterii S. Typhimurium szczepu VNP20009 stransformowanych plazmidem kodującym natywną formę białka SipB na komórki linii monocytarno-makrofagowej RAW264.7. Analizując krzywe wzrostu bakterii oraz ich żywotność stwierdziłam, że nadekspresja natywnej formy białka SipB tylko nieznacznie wpływa na analizowane parametry określające kondycję bakterii. Stosując test gentamycynowy zbadałam wpływ nadekspresji SipB na zakażalność komórek RAW264.7 – być może synteza SipB upośledza zakażalność tych komórek monocytarno-makrofagowych, jednak wynik, ze względu na znaczące odchylenie standardowe, nie jest statystycznie istotny. Sprawdziłam czy zakażanie komórek bakteriami z nadekspresją SipB powoduje wzmożenie śmiertelności komórek linii monocytarno-makrofagowej RAW264.7. Otrzymałam wynik negatywny. Wynik ten zweryfikowałam stosując linię komórek RAW264.7 stabilnie stransfekowaną wektorem kodującym białko adaptorowe ASC, aktywator kaspazy-1 (komórki RAW264.7-ASC+). RAW264.7-ASC+ wykazywały wzmożoną śmiertelność po stymulacji LPS-em w porównaniu z komórkami nietransfekowanymi, ale stopień ich śmiertelności w odpowiedzi na VNP20009 z nadekspresją SipB był taki sam jak stopień ich śmiertelności w odpowiedzi na VNP20009 stransformowane kontrolnym plazmidem.

SipB (Salmonella Invasion Protein B) protein is a part of Type III Secretion System, which takes part in the eukaryotic cell invasion. Apart from its involvement in the process of infection, SipB is one of the effector proteins. It is secreted into host cells and participates in caspase-1 activation and maturation of IL-1β and IL-18. SipB is also suspected to cause cell death. Our team raised the hypothesis that overexpression of SipB by S. Typhimurium can increase anti-tumor activity of this bacteria. We believe that Salmonella-mediated elimination of macrophages, which promote immunosupresive environment in the tumor tissue, could be one of the mechanisms of antitumor effects of bacteria. The purpose of my work was to analyze whether overexpression of a native form of SipB (nSipB) by S. Typhimurium potentiates the cytotoxic effects of bacteria towards RAW264.7 macrophage cell line. The analysis of bacteria growth and viability revealed that the overexpression of nSipB does not significantly affect bacteria proliferation rate and survival. I also analyzed the potential effect of nSipB overexpression on the ability of Salmonella to infect RAW264.7 using the gentamycine protection assay. It is possible that this process is to some degree inhibited by production of SipB, however the high standard deviation in these experiments did not allow for unequivocal statement. Next, I investigated whether the overexpression of SipB by Salmonella increases the mortality rate of RAW264.7 cells upon bacterial infection. The result was negative. The result was verified by using RAW264.7 cells stably transfected with a vector coding for the adaptor protein ASC, which is caspase-1 activator (RAW264.7 ASC+ cells). LPS stimulation of RAW264.7 ASC+ cells resulted in a higher mortality rate as compared to the untransfected cells (RAW264.7), but their mortality in response to infection with SipB-overexpressing Salmonella was the same as after infection with bacteria transformed with a control plasmid.