Effect of gemtuzumab ozogamicin on the cell cycle and apoptosis in acute myeloid leukemia cells

Ostra białaczka szpikowa (AML) stanowi heterogenną grupę nowotworów układu hematopoetycznego. Choroba ta jest najczęściej diagnozowanym typem białaczki wśród dorosłych i charakteryzuje się najwyższą śmiertelnością. Obecnie poszukiwane są bardziej efektywne formy terapii, które pozwolą na uzyskanie całkowitej remisji u pacjentów z AML. Zaobserwowano, iż w AML dochodzi do akumulacji nieprawidłowych komórek blastycznych, które w 85-90 % wykazują ekspresję antygenu CD33 (Siglec-3). CD33 jest obecny w błonie komórek białaczkowych, natomiast prawidłowe hematopoetyczne komórki macierzyste oraz komórki niehematopoetyczne nie wykazują jego ekspresji. Obserwacje te czynią CD33 atrakcyjnym celem dla terapii z użyciem przeciwciał monoklonalnych skierowanych na ten antygen. Rozwój immunoterapii umożliwił zaprojektowanie gemtuzumabu ozogamycyny (GO, Mylotarg), który należy do koniugatów przeciwciało-lek. W skład GO wchodzi humanizowane mysie przeciwciało klasy IgG4 oraz cytotoksyczna pochodna kalicheamycyny. GO posiada zdolność wykrywania receptora CD33 i specyficznego łączenia się z nim, dzięki czemu do komórki nowotworowej w sposób celowany wprowadzany jest związek cytotoksyczny, który indukuje jej apoptozę.Celem niniejszej pracy było określenie cytotoksycznej aktywności gemtuzumabu ozogamycyny wobec komórek AML w warunkach mono- i kokultury in vitro. W warunkach monokultury przeprowadzono analizę zmian w żywotności, przebiegu cyklu komórkowego oraz indukcji apoptozy w trzech liniach komórkowych AML: KG-1, ML-1 oraz MV4-11. Biorąc pod uwagę istotną rolę podścieliska szpiku kostnego w rozwoju białaczki i oporności komórek białaczkowych na terapię, w warunkach kokultury, zbadano wpływ komórek podścieliska szpiku kostnego linii HS-5 na odpowiedź komórek AML na działanie GO. Zaobserwowano, iż wykorzystane w doświadczeniach linie komórkowe AML różnią się poziomem ekspresji CD33, a także odpowiedzią na działanie GO. Najbardziej wrażliwą okazała się być linia MV4-11, a największą oporność wykazały komórki linii KG-1. GO powodował zatrzymanie komórek w fazie G2/M cyklu komórkowego, a także indukcję apoptozy, jednak odpowiedź komórek AML na Mylotarg nie korelowała z poziomem ekspresji antygenu CD33. Wykazano również, iż komórki podścieliska szpiku kostnego wpływają ochronnie na komórki AML, zmniejszając efekt działania GO. Otrzymane w niniejszej pracy wyniki są istotne z punktu widzenia oceny efektywności terapii z zastosowaniem GO, co wymaga dalszych badań nad mechanizmami odpowiedzialnymi za obserwowane efekty.

Acute myeloid leukemia (AML) is a term for heterogeneous group of hematopoietic malignancies. It is most prevalent type of leukemia among adults, moreover patients diagonosed with AML have a higher mortality rate than those with diagnosed with other variants of leukemia. Currently, more effective forms of therapy are sought, which will allow achieving complete remission in patients with AML. It has been observed, in AML cancer cells, that there is an accumulation of abnormal blast cells, which in 85-90% of cases (or of the time) express the antigen CD33 (Siglec-3).  Leukemic cells express CD33, as the antigen is found in their membrane, whereas normal hematopoietic stem cells and non-hematopoietic cells do not express it. These observations make CD33 an attractive target for targeted therapies using monoclonal antibodies directed to this antigen. The development of immunotherapy enabled the design of gemtuzumab ozogamicin (GO, Mylotarg), which belongs to antibody-drug conjugates. GO consists of a humanized murine IgG4 antibody and a cytotoxic derivative of calicheamicin. GO can, both detect the CD33 receptor and bind to it, thanks to which a cytotoxic compound is introduced into the cancer cell in a targeted manner; this induces its apoptosis.The aim of the study was to describe the cytotoxic activity of gemtuzumab ozogamicin against AML cells in mono- and co-culture conditions in vitro. Changes in viability, cell cycle progression and apoptosis induction in three AML cell lines: KG-1, ML-1 and MV4-11 were analyzed under monoculture conditions. In addition, considering the important role of bone marrow stromal cells in the development of leukemia and the resistance of leukemic cells to therapy, under coculture conditions, the effect of HS-5 bone marrow stromal cells on the response of AML cells to GO was investigated.It was observed that the AML cell lines used in the experiments differ in the level of CD33 expression, as well as in the response to GO. The MV4-11 line turned out to be the most sensitive, and the KG-1 line showed the greatest resistance. GO caused arrest in the G2/M phase of the cell cycle as well as induction of apoptosis, however, no correlation was found between the response of AML cells to Mylotarg and the given level of CD33 antigen expression. It has also been shown that bone marrow stromal cells have a protective effect on AML cells, reducing the effect of GO. The results obtained in this study are important from the point of view of assessing the effectiveness of GO therapy, which requires further research on the mechanisms responsible for the observed effects.