Application of the fluorescent dyes for flow cytometry analysis of lymphocyte proliferation

Metoda oparta na inkorporacji tymidyny znakowanej trytem [3H]tymidyna) od lat jest stosowana jako „złoty standard” do pomiaru proliferacji komórek. W technice tej, [3H]tymidyna wbudowuje się do nowosyntezowanego DNA, a proliferacja komórek koreluje z radiacją próbki mierzoną w liczniku scyntylacyjnym. Cytometria przepływowa daje alternatywną możliwość wykorzystania nieradioaktywnych znaczników jakimi są ester karboksyfluoresceiny i kwasu bursztynowego (CFSE) oraz etynylodeoksyurydyna (EdU). CFSE jest barwnikiem fluorescencyjnym łączącym się do białek cytoszkieletu komórki. Wraz z każdym podziałem komórkowym intensywność fluorescencji wyznakowanych CFSE komórek maleje o połowę. W metodzie tej oprócz pomiaru stopnia proliferacji komórek można również śledzić liczbę podziałów komórkowych. EdU jest natomiast nieradioaktywnym analogiem tymidyny, który wbudowuje się do nowosyntezowanego DNA. Miejsca inkorporacji EdU są wykrywane w tzw. reakcji „click” katalizowanej przez jony miedzi (I). W przedstawionych badaniach oceniano proliferację limfocytów krwi obwodowej trzema wymienionymi metodami, po stymulacji fitohemaglutyniną (PHA), przeciwciałami anty-CD3 (aCD3) lub tuberkuliną (PPD). W trzecim, piątym i siódmym dniu hodowli przeprowadzano pomiary scyntylacyjne dla hodowli znakowanej [3H]tymidyną i analizę cytometryczną dla komórek znakowanych CFSE lub EdU. W celu oceny proliferacji obliczano indeks stymulacji (SI) dla [3H]tymidyny i indeks podziałów komórkowych (CDI) dla metod cytometrycznych. Uzyskane wyniki pozwalają stwierdzić, iż metoda z użyciem [3H]tymidyny może być z powodzeniem zastąpiona przez metody cytometryczne oparte na pomiarze fluorescencji. Dodatkowo, metody z wykorzystaniem CFSE i EdU pozwalają również określić fenotyp analizowanych komórek.

Incorporation of tritiated thymidine ([3H]thymidine) is used for years as a “gold standard” for analysis of cell proliferation. In this technique, a radioactive analog of thymidine incorporates into newly synthesized DNA and the cell proliferation rate correlates with radiation of the sample, measured by a scintillation counter. A nonradioactive methods, using carboxylfluorescein diacetate succinimidyl ester (CFSE) or ethynyl deoxyuridine (EdU) and flow cytometry analysis are possible alternatives. CFSE is a fluorescent dye that binds to proteins of cytoskeleton. As a result, fluorescence intensity of CFSE halves with each cell division. In this assay, besides cell proliferation measurement, the number of cell divisions can be tracked. EdU is a nonradioactive analog of thymidine which incorporates into newly synthesized DNA, and is detected by the Cu(I)-catalyzed “click” reaction. In this study, peripheral blood mononuclear cells (PBMC) were stimulated with phytohemaglutinin (PHA), anti-CD3 antibody (aCD3) or purified protein derivatives of tuberculin (PPD) and their proliferation was analyzed using these three assays. A scintillation measurement for [3H]thymidine and cytometric analysis for CFSE and EdU were performed in the 3rd, 5th and 7th day of culture. To estimate the proliferation, stimulation index (SI) for [3H]thymidine and cell division index (CDI) for CFSE and EdU were counted. The obtained results may suggest that the radioactive method can be successfully replaced by fluorescence-based cytometric assays. Moreover, the CFSE and EdU-based assays may allow to determine the phenotype of analyzed cells.