The analysis of cryoprotective properties of trimethylamine oxide and its effect on paramagnetic properties of the iron-sulfur cluster in cytochrome bc1

Cytochrom bc1 jest jednym z kluczowych enzymów szlaków bioenergetycznych w komórce. Jedną z trzech katalitycznych podjednostek tego enzymu jest białko żelazowo-siarkowe (ISP), którego domena zawierająca klaster Rieskiego (FeS) podczas cyklu katalitycznego wykonuje ruch pomiędzy miejscem wiązania substratu (Qo) a podjednostką cytochromu c1. Znaczna część informacji na temat roli ISP uzyskano z wykorzystaniem spektroskopii elektronowego rezonansu paramagnetycznego (EPR) w niskich temperaturach. Z badań wynikało, że widmo EPR klastra jest czułe na oddziaływanie z substancjami związanymi w Qo zawierającymi grupy -OH oraz >C=O takimi jak ubichinol, ubichinon czy inhibitory cytochromu bc1, które modyfikują położenie podjednostki ISP. Ponieważ większość eksperymentów EPR przeprowadzono w warunkach, w których białko znajdowało się w zamarzniętym roztworze bez dodatków krioprotektantów istnieje możliwość, że zmiany na widmie FeS spowodowane są wpływem powstających kryształów lodu na białko. Zaobserwowano, że dodatek krioprotektantów takich jak glicerol wywołuje zmiany w widmie EPR klastra, co powszechnie tłumaczone jest uwalnianiem domeny ISP poprzez wypieranie ubichinonu z Qo przez cząsteczki zawierające grupy -OH. W niniejszej pracy przebadano skuteczność krioprotekcyjną tlenku trimetyloaminy (TMAO), który nie zawiera grupy -OH oraz zbadano jego wpływ na widmo FeS w celu weryfikacji hipotezy, że zmiany na widmie EPR w obecności krioprotektantów wynikają z obecności grupy -OH tych związków w miejscu Qo. Z przeprowadzonych badań wynika, że TMAO jest równie skutecznym krioprotektantem co glicerol. Zaobserwowane zmiany na widmie klastra w formach cytochromu bc1 z nieaktywnym miejscem Qo w obecności TAMO i glicerolu świadczą o wpływie krioprotektantów na strukturę ISP niezależnie od obecności grupy -OH. Odmienny efekt TMAO na widmo FeS kompleksu izolowanego oraz kompleksu w błonie świadczy o co najmniej dwóch mechanizmach oddziaływania TMAO z cytochromem bc1. Dodatkowo w pracy stwierdzono liniową zależność szybkości relaksacji spinowo-sieciowej od anizotropii widma FeS co świadczy o dominacji mechanizmu Ramana w temperaturach helowych.

Cytochrome bc1 is a key enzyme of bioenergetic pathways in the cell. The iron-sulfur protein (ISP) is one of three catalytic subunits of this enzyme. Its domain consists of the Rieske type iron-sulfur cluster (FeS) and moves during catalitic cycle between the substrate binding site (Qo) and the cytochrome c1 subunit. A large piece of information about ISP has been obtained by means of electron paramagnetic resonance spectroscopy (EPR) in low temperatures. The experiments have demonstrated that EPR spectrum of FeS is sensitive to interactions with molecules containing -OH and >C=O groups bonded in the Qo site such as ubichuinon, ubichinol or inhibitors of cytochrome bc1 which modify the ISP position. Most of EPR experiments have been performed in conditions where the protein was frozen in solution without cryoprotective agents. Therefore, it is possible that the changes of the EPR spectrum of FeS occur because of the formation of ice crystals which affects protein structure. It has been observed that addition of cryoprotective agents such as glycerol causes the changes in the EPR spectrum of FeS. This phenomen is explained by the release of ISP domain by replacing ubichinon for molecules with -OH groups in Qo site. In this thesis cryoprotective features of the hydroxyl group-free trimethylamine oxide (TMAO) and its influence on EPR spectra of the FeS were investigated to verify the hypothesis that changes in EPR spectra when cryoprotective agents are present are due to presence of -OH groups of these compounds in Qo site. The changes of EPR spectra of the FeS in mutants of cytochrome bc1 with inactive Qo site in the presence of TMAO or glycerol have been observed. They suggest that cryoprotective agents have impact on structure of the ISP independently of -OH groups presence. TMAO has a different effect on spectra of FeS in isolated cytochrome bc1 from the effect on spectra of FeS in the enzyme in membrane which suggests that there are two or more mechanisms of interaction of TMAO with cytochrome bc1. Additionally, a linear relationship between spin-latice relaxation rate and the anisotropy of the FeS spectra has been observed. That shows that the Raman process is dominant in tempertures close to the temperature of liquid helium.