Imaging of endothelial cell dysfunction through spectroscopic tags by means of Raman microscopy

Komórki śródbłonka odgrywają kluczową rolę w utrzymywaniu homeostazy organizmu, poprzez wydzielanie szeregu substancji regulujące funkcje i pracę naczyń krwionośnych. Dlatego też, dysfunkcja śródbłonka odgrywa znaczącą rolę w powstawaniu i przebiegu, różnych chorób m.in: miażdżycy, cukrzycy, nadciśnieniu, rozwoju nowotworów oraz chorób niedokrwiennych serca. Szybka detekcja zmian zachodzących w komórkach związana z ich dysfunkcją ma wpływ na dalsze kroki w skutecznej terapii chorobowej. Celem niniejszej pracy było zobrazowanie dysfunkcji komórek śródbłonka przy pomocy związków chemicznych pełniących rolę znaczników ramanowskich z wykorzystaniem mikroskopii ramanowskiej. Znacznikami tymi były dwa deuterowane nasycone kwasy tłuszczowe (mirystynowy (MA-d27) i palmitynowy (PA-d31)) oraz astaksantyna (AXT), karotenoid wykazujący rezonansowy efekt ramanowski. W eksperymencie przedmiotem badań były ludzkie mózgowe komórki śródbłonka (HBEC), a dysfunkcja komórek reprezentowana była przez model stanu zapalnego in vitro, wywołany stymulacją komórek czynnikiem martwicy nowotworów-α (TNF- α). Za pomocą integracji pasm charakterystycznych uzyskano mapy ramanowskie obrazujące dystrybucję użytych związków chemicznych, natomiast analiza skupień metodą k-średnich (KMC) pozwoliła uzyskać informacje o rozmieszczeniu oraz składzie struktur wewnątrzkomórkowych. Uzyskane dane wykazały, że stan zapalny w komórkach manifestuje się obecnością kropli lipidowych, a w komórkach inkubowanych PA-d31 oraz MA-d27 na widmie ramanowskim obserwowany jest charakterystyczny sygnał przy ok. 2100 cm-1, wskazujący na wychwyt i akumulację egzogennych kwasów w tych strukturach. Stwierdzono również na podstawie analizy KMC oraz obliczonego stosunku intensywności pasm drgań rozciągających CH/CD, że długość łańcucha węglowodorowego ma wpływ na wychwyt kwasów tłuszczowych przez komórki w stanie zapalnym. W badaniu tym wykazano, także że wprowadzenie AXT do komórek umożliwia szybką detekcję lipidów w komórce, których dystrybucja przestrzenna zmienia się w trakcie stanu zapalnego.

Endothelial cells play an important role in maintaining the homeostasis of the body through the substances they release. Therefore, endothelial dysfunction plays a significant role in the formation and course of various diseases, including atherosclerosis, diabetes, hypertension, cancer development and coronary heart disease. Fast detection of changes in cells associated with their dysfunction has an impact on further steps in effective disease therapy.The purpose of this study was to visualize endothelial cell dysfunction using chemical compounds that act as tags using Raman microscopy. These tags were two deuterated saturated fatty acids (deuterated myristic (MA-d27) and palmitic (PA-d31) fatty acids) and astaxanthin (AXT), a carotenoid exhibiting a Raman resonant effect. The experiments were done with using human brain endothelial cell line (HBEC) and inflammatory model of cell dysfunction was represented by an in vitro due to stimulation of the cells with tumor necrosis factor-α (TNF- α). Raman images illustrating the distribution of selected chemical compounds used were obtained by integrating marker bands, while cluster analysis using k-means (KMC) allowed obtaining information on the distribution and composition of intracellular structures.The obtained data showed that inflammation in cells is manifested by the presence of lipid droplets (LDs), and in cells incubated PA-d31 and MA-d27 in the Raman spectrum a characteristic signal at about 2100 cm-1 is observed, indicating the accumulation of exogenous acids in these structures. It was also found on the basis of KMC analysis and the calculated intensity ratio of CH and CD stretching bands that the length of hydrocarbon chain has an effect on the uptake of fatty acids by inflammatory cells. This study also showed that the induction of AXT into cells allows rapid detection of lipids in the cell whose spatial distribution changes during inflammation.