MCPIP1 influence on NF-κB and MAP kinase signaling pathway in HeLa cells stimulated with TNFα.

The main goals of the presented thesis were: - the identification of proteins interacting with MCPIP1 in vivo and the influence of MCPIP1 for their amount - investigation the influence of MCPIP1 on activation of NF-κB pathway and cascade of MAPKs - test the cellular localization of MCPIP1The experimental model used in this study was HeLa cell line stimulated with TNFα. In the first part of this study, it was shown, that TRAF2 and TANK proteins involved in the activation of the NF-κB pathway interact with MCPIP1 in vivo. Furthermore, their amount in cells overexpressing MCPIP1 was higher compared to the control. During the second part of the report, the mechanism by which MCPIP1 negatively regulates p65 activity was analyzed. Obtained data indicated, that MCPIP1 and its mutants (ΔUba, ΔCue) did not affect p65 translocation to the nucleus after stimulation with TNFα. Additionally the degradation of IκBα was not affected by MCPIP1 overexpression. The third part of the work focused on the effect of higher expression level of MCPIP1 on MAPKs activation by TNFα. Presented data revealed that MCPIP1 probably did not affect the phosphorylation pattern of ERK1/2 and JNK kinases. However, MCPIP1 seemed to be a negative regulator of p38 kinase activation. The final part of the study is concentrated on the cellular localization of endogenous and overexpressed MCPIP1. Endogenous MCPIP1 is localized in the cytosol and the nucleus as well. Cell stimulation with TNFα probably induced the translocation the part of MCPIP1 to the nucleus (the same trend was observed in cells with MCPIP1 overexpression and stimulation). Higher expression level of MCPIP1 led to the cytosolic stress granules formation, which was enhanced by the stimulation with TNFα. Presented results confirm significance of MCPIP1 in modulation of the inflammatory process. The studied protein is a potent and excellent target for the gene therapy. Nevertheless further research should be performed, to understand the molecular mechanism of MCPIP1 activity in inflammation.

Głównymi celami przedstawionej pracy magisterskiej była identyfikacja partnerów białkowych oddziałujących z MCPIP1 in vivo oraz wpływ na ich ilość, sprawdzenie wpływu MCPIP1 na szlak aktywacji czynnika transkrypcyjnego NF-κB oraz kaskady kinaz MAP, a także zbadanie lokalizacji komórkowej MCPIP1. Jako model badawczy wykorzystywano komórki linii HeLa stymulowane cytokiną prozapalną TNFα. W pierwszej części niniejszej pracy wykazano oddziaływanie MCPIP1 in vivo z białkami zaangażowanymi w ścieżkę aktywacji czynnika NF-κB – TRAF2 oraz TANK. Ponadto nadekspresja MCPIP1 powoduje wzrost ilości TRAF2, TRAF6 oraz TANK. W drugiej części pracy w celu zbadania mechanizmu poprzez który MCPIP1 negatywnie reguluje aktywność p65, sprawdzono wpływ zwiększonego poziomu ekspresji MCPIP1 oraz jego mutantów (ΔUba, ΔCue) na translokację p65 do jądra po stymulacji komórek TNFα. Przeprowadzone badania wykazały brak wpływu MCPIP1 na translokację p65 do jądra, ponadto dalsze eksperymenty dowiodły braku wpływu MCPIP1 na kinetykę degradacji IκBα. W trzeciej części pracy sprawdzono wpływ MCPIP1 na aktywację kaskady kinaz MAP w komórkach traktowanych TNFα. Na podstawie przeprowadzonych badań można sądzić, że MCPIP1 prawdopodobnie nie wpływa na wzór fosforylacji kinaz ERK1/2 oraz JNK. Natomiast można przypuszczać, że MCPIP1 jest negatywnym regulatorem aktywacji kinazy p38. W ostatniej części pracy zbadano lokalizację komórkową MCPIP1 za pomocą immunofluorescencji. Endogenny MCPIP1 lokalizuje się zarówno w jądrze jak i w cytoplazmie, natomiast po stymulacji komórek TNFα część MCPIP1 ulega prawdopodobnie translokacji do jądra (podobna tendencja obserwowana podczas nadekspresji MCPIP1). Natomiast zwiększony poziom ekspresji MCPIP1 powoduje pojawienie się granul stresowych w cytoplazmie, a stymulacja TNFα przyczynia się do zwiększenia ich liczby. Przedstawione wyniki świadczą o niebagatelnej roli MCPIP1 w modulacji stanu zapalnego. Białko to stanowi potencjalny cel terapii genowej, jednakże zastosowania aplikacyjne należy poprzedzić dogłębnym poznaniem mechanizmu molekularnego, poprzez który MCPIP1 moduluje stan zapalny.