Role of non-classical testosterone signaling in the regulation of the Notch pathway in Sertoli cells

Sygnalizacja androgenowa oraz szlak sygnałowy Notch pełnią kluczową rolę w kontroli funkcji gonady męskiej ssaków, a zakłócenia w przebiegu tych szlaków prowadzą do zaburzeń spermatogenezy, co skutkuje obniżoną płodnością lub bezpłodnością. Ostatnie badania wykazały, że w komórkach somatycznych nabłonka plemnikotwórczego - komórkach Sertoliego - istnieją wzajemne oddziaływania między sygnalizacją androgenową a szlakiem Notch, jednak dokładne mechanizmy odpowiedzialne za te interakcje wciąż wymagają wyjaśnienia.Celem niniejszej pracy było zbadanie roli nieklasycznych mechanizmów sygnalizacji androgenowej w regulacji szlaku sygnałowego Notch w komórkach Sertoliego. Do badań wykorzystano linię mysich komórek Sertoliego TM4, w których blokowano nieklasyczne mechanizmy działania testosteronu przy użyciu inhibitorów kinaz PI3K, MEK oraz Src. Aby ocenić wpływ inhibicji na aktywność szlaku Notch, zbadano zmiany w ekspresji trzech komponentów tego szlaku – aktywnej formy receptora Notch1 (N1ICD), białka efektorowego HES1 i liganda DLL1 - z wykorzystaniem technik Western blot oraz immunofluorescencji.Zablokowanie kinaz PI3K, MEK oraz Src powodowało spadek stymulowanej testosteronem ekspresji białek N1ICD oraz HES1 w komórkach Sertoliego. Wyniki analizy immunofluorescencyjnej wykazały ponadto, że testosteron obniżył ekspresję DLL1, natomiast blokowanie aktywności kinaz PI3K i MEK znosiło ten efekt. Uzyskane wyniki dowiodły, że nieklasyczne mechanizmy sygnalizacji androgenowej z udziałem kinaz białkowych uczestniczą w regulacji aktywności szlaku Notch w komórkach Sertoliego. Dalsze badania nad interakcjami między tymi szlakami są niezbędne do lepszego zrozumienia fizjologii komórek Sertoliego i ich roli w regulacji procesu spermatogenezy.

Androgen signaling and Notch pathway are involved in the control of testicular function in mammals. Disruption in these pathways leads to impaired spermatogenesis, resulting in reduced fertility or infertility. Recent studies have shown an interplay between androgen signaling and Notch pathway in Sertoli cells - somatic cells of seminiferous epithelium, but the exact mechanisms behind these interactions still need to be elucidated. The aim of this study was to investigate the role of non-classical androgen signaling in the regulation of the Notch pathway in Sertoli cells. Experiments were performed on mouse Sertoli cell line TM4. Non-classical testosterone signaling was blocked with the use of PI3K, MEK and Src kinase inhibitors. Western blot and immunofluorescence techniques were used to determine the effect of this inhibition on Notch pathway activity by examining changes in the expression of Notch pathway proteins – activated form of Notch1 receptor (N1ICD), effector protein HES1 and ligand DLL1.Blockage of PI3K, MEK and Src kinases decreased testosterone-stimulated expression of N1ICD and HES1 proteins. In addition, immunofluorescence analysis demonstrated that testosterone reduced DLL1 expression in Sertoli cells, while inhibition of PI3K and MEK kinases abolished this effect. These results provided evidence that non-classical androgen signaling mediated through protein kinases is involved in the regulation of Notch pathway activity in Sertoli cells. Further research into the interactions between these pathways is needed to better understand Sertoli cell physiology and mechanisms controlling spermatogenesis in mammals.