The role of itaconic acid in the inflammatory response of murine macrophages RAW 264.7

Kwas itakonowy jest organicznym, nienasyconym, kwasem dikarboksylowym wykorzystywanym od lat w przemyśle. Jego biosynteza opiera się głównie o katalizę kwasu cis-akonitowego w komórkach grzyba Aspergillus terreus, jednak może zachodzić także w pro-zapalnie aktywowanych ssaczych makrofagach. Synteza kwasu itakonowego zachodzi podczas nietypowego cyklu Krebsa, zwanego broken Krebs cycle i jest katalizowana przez dwa enzymy; odpowiednio dla grzyba – CAD oraz CAD/IRG1 dla ssaków. Badania nad kwasem itakonowym wykazały jego przeciwzapalną rolę, która związana jest z mechanizmami immunometabolicznymi. Celem niniejszej pracy było określenie roli kwasu itakonowego w odpowiedzi zapalnej mysich makrofagów linii RAW 264.7, które traktowano 4-oktyl itakonianem (4-OI) w różnych stężeniach. Dodatkowo komórki traktowano rozpuszczalnikiem dla 4-OI - dimetylosulfotlenkiem (DMSO) oraz zastosowano 2-deoksy-D-glukozę jako kontrolę pozytywną. Część komórek stymulowano lipopolisacharydem (LPS) w stężeniu 10 μg/ml. Rolę kwau itakonowego w odpowiedzi zapalnej zbadano poprzez pomiar stężenia wydzielanego przez makrofagi linii RAW 264.7 tlenku azotu (NO) metodą Griess’a oraz oznaczenie ekspresji indukowalnej syntazy tlenku azotu (iNOS) techniką immunocytochemiczną. Dodatkowo zbadano żywotność komórek testem PrestoBlue oraz zmierzono ich aktywność metaboliczną testem MTT. Uzyskane wyniki jednoznacznie wykazują, że kwas itakonowy zmniejsza stężenie wydzielanego tlenku azotu w pro-zapalnie zaktywowanych makrofagach oraz prawie całkowicie hamuje ekspresję iNOS w komórkach stymulowanych LPS, nie wpływając przy tym na żywotność i aktywność metaboliczną makrofagów. Wyniki te wskazują, że kwas itakonowy wpływa na zmianę fenotypu komórek z makrofagów pro-zapalnych (M1) na makrofagi przeciwzapalne (M2). Hipoteza ta wymaga jednak dalszych analiz, dlatego w przyszłości należałoby poszerzyć badania o oznaczenie stężenia cytokin pro-zapalnych i przeciwzapalnych.

Itaconic acid is an organic, unsaturated, dicarboxylic acid that has been used in industry for years. Its biosynthesis is based mainly on the catalysis of cis-aconitic acid in Aspergillus terreus fungal cells, but it can also occur in pro-inflammatory mammalian macrophages. The synthesis of itaconic acid occurs during an atypical Krebs cycle, called broken Krebs cycle, and is catalyzed by two enzymes; respectively for the fungus - CAD and CAD / IRG1 for mammals. Studies on itaconic acid have demonstrated its anti-inflammatory role which is associated with immunometabolic mechanisms. The aim of this study was to determine the role of itaconic acid in the inflammatory response of murine macrophages of the RAW 264.7 cell line by their treatment with various concentrations of 4-octyl itaconate (4-OI). In addition, the cells were treated with dimethylsulfoxide solvent (DMSO) of 4-OI, and 2-deoxy-D-glucose was used as a positive control. Some of the cells were stimulated with lipopolysaccharide (LPS) at a concentration of 10 μg / ml. The role of itaconic acid in the inflammatory response was examined by measurement of concentration of nitric oxide (NO) by the Griess reaction and by estimation of expression of inducible nitric oxide synthase (iNOS) by immunocytochemistry. In addition, the cell viability was examined with the PrestoBlue test and their metabolic activity was measured by the MTT test. The obtained results clearly show that itaconic acid reduces the concentration of secreted nitric oxide by pro-inflammatory macrophages and almost completely inhibits the expression of iNOS in LPS-stimulated cells, without affecting the viability and metabolic activity of macrophages. The obtained data suggest that itaconic acid drives the change of the phenotype of macrophages from the pro-inflammatory (M1) to the anti-inflammatory (M2) ones. However, this hypothesis requires further analysis which is why in the future studies to determine the concentration of pro-inflammatory and anti-inflammatory cytokines should be undertaken.