Preparation of C2C12 stable cell line with mikroRNA-378a overexpression

Wektory wirusowe stanowią jedno z kluczowych narzędzi terapii genowej. Gen terapeutyczny a także geny selekcyjne i markerowe zostają wprowadzone w miejsce pewnych genów wirusa typu dzikiego. Wektory wirusowe mają wiele zalet: zapewniają dużą wydajność transdukcji komórek gospodarza, a także wysoką ekspresję transgenu. Natomiast mikroRNA (miRNA, miR) są krótkimi, jednoniciowymi niekodującymi odcinkami RNA, które biorą udział w potranskrypcyjnej regulacji ekspresji genów. MiRNA-378a może być ciekawą cząsteczką w kontekście badań dotyczących biologii mięśni szkieletowych. W celu zadania wpływu miRNA-378a na różnicowanie komórek mięśniowych przygotowano linię komórkową mysich mioblastów C2C12 z stabilną nadekspresja miRNA-378a, co zostało opisane w pracy. Do transdukcji użyto wektory lentiwirusowe, mogące wprowadzać transgen do komórek dzielących się jak i niedzielących. Wektory lentiwirusowe, oprócz genu kodującego miRNA-378a, zawierały także gen kodujący oporność na puromycynę a także gen kodujący białko zielonej fluorescencji (GFP), pozwalające na późniejszą selekcję. Uzyskane wyniki z przeprowadzanych doświadczeń: obserwacji mikroskopowej fluorescencji GFP oraz cytometrii przepływowej, powalają stwierdzić uzyskanie linii komórkowej ze stabilna nadekspresja mikroRNA-378a.

Viral vectors are crucial tools in gene therapy. Therapeutic gene and maker genes replace some of virus genes. Viral vectors have many advantages: the capability of efficient gene transfer in cells and high delivery genes expression. MicroRNA (miRNA, miR) are short, single-stranded, non-coding RNA molecules that function as post-transcriptional regulators of gene expression. MicroRNA-378a seems to be interesting molecule in research of skeletal muscles biology. In order to study of the miRNA-378a influence on muscle cells differentiation, C2C12 cell line with miRNA-378a overexpression was prepared. Lentiviral vectors, which have the capability of infecting both dividing and non-dividing cells were used to transfer gene of interest to C2C12 cells. The lentiviral vector construct contained puromycin resistant gene and Green Fluorescence Protein (GFP) gene, which presence allowed future selection cells after transduction. The results from microscopic analysis of GFP and flow cytometric let us affirm the obtainment of C2C12 stable cell line with miRNA-378a overexpression.