Development and characterization of a reporter system to study Rev-dependent HIV-1 RNA export

Ludzki wirus niedoboru odporności (HIV-1) prowadzi do zespołu nabytego niedoboru odporności (AIDS). Należy on do rodzaju Lentivirus wchodzącego w skład rodziny Retroviridae. Przynależność do tych jednostek taksonomicznych stanowi odzwierciedlenie najważniejszych cech cyklu replikacyjnego HIV-1, ponieważ podobnie jak wszystkie retrowirusy, HIV-1 wykorzystuje enzym, odwrotną transkryptazę, do przepisania RNA na DNA, a jako lentiwirus charakteryzuje się długim okresem inkubacji Po integracji swojego materiału genetycznego, wirus może przejść w stan latencji, przez co pełne wyleczenie infekcji jest niemożliwe. Stan latencji regulowany jest na poziomie transkrypcyjnym i potranskrypcyjnym, z czego do tej pory najlepiej zostały poznane bloki transkrypcyjne. Regulacja potranskrypcyjna powiązana jest z procesami takimi jak: alternatywny splicing, stabilność RNA oraz eksport wirusowego RNA z jądra do cytoplazmy przez białko Rev. Jedną z proponowanych terapii leczniczych infekcji wirusem HIV-1, jest terapia „shock and kill”. Terapia ta zakłada reaktywację wirusa z stanu latencji przy użyciu związków chemicznych LRA (ang. latency reversing agents), które uwalniają blokady transkrypcyjne. Wybudzone z latencji komórki umierają na skutek efektów cytopatycznych lub cytolitycznych, chroniąc jednocześnie zdrowe komórki stosując leki antyretrowirusowe. Terapia ta, na ten moment nie wykazuje pełnej skuteczności, gdyż mało wydajna reaktywacja wirusa z stanu latencji z użyciem LRAs jest tylko jednym z wielu elementów odpowiedzialnych za nieskuteczność terapii „shock-and-kill”. LRAs wpływają wyłącznie na bloki latencji transkrypcyjnej, bez wpływu na bloki potranskrypcyjne, dlatego też istotnym jest pełne poznanie mechanizmów odpowiedzialnych za latencję potranskrypcyjną. Charakterystyka tych mechanizmów umożliwi uwolnienie bloków potranskrypcyjnych, a tym samym ulepszenie skuteczności terapii „shock and kill”.Celem pracy magisterskiej było opracowanie i charakterystyka systemu reporterowego o podwójnej fluorescencji w celach badawczych potranskrypcyjnego Rev-zależnego eksportu RNA wirusa HIV-1. Poprzez serię testów wykorzystujących inhibitory aktywności białka Rev udowodniono, że opracowany model wykazuje specyficzną odpowiedź tj. zwiększenie ekspresji fluorescencyjnego białka reporterowego mKO2. Model ten, z racji na swój niezakaźny charakter, może być wykorzystywany w laboratoriach niewyposażonych w przestrzeń laboratoryjną klasy BSL3, zapewniając bezpieczeństwo pracy z jakością badań zbliżoną do pracy z pełnym wirusem.Opracowana linia komórkowa stanowi zatem użyteczne narzędzie do identyfikacji i charakterystyki nowych czynników komórkowych stanowiących potencjalne cele terapeutyczne i zaangażowanych w potranskrypcyjny blok latencji wirusa HIV-1, a w szczególności w blok eksportu RNA wirusowego z jądra do cytoplazmy.

The Human Immunodeficiency Virus (HIV-1) leads to Acquired Immunodeficiency Syndrome (AIDS). It belongs to the genus Lentivirus which is part of the family Retroviridae. Being a member of these taxonomic units reflects the most important features of the HIV-1 replication cycle, because, like all retroviruses, HIV-1 uses an enzyme, reverse transcriptase, to transcribe its RNA into DNA, and as a lentivirus it is characterized by a long incubation period. Once its genetic material is integrated, the virus can enter a state of latency, making a full cure of the infection impossible.. The state of latency is regulated at the transcriptional and post-transcriptional levels, of which the transcriptional blocks have been best understood to date. Post-transcriptional regulation is associated with processes such as alternative splicing, RNA stability, and the export of viral RNA from the nucleus to the cytoplasm by the viral Rev protein. One of the proposed therapeutic cure strategies is "shock and kill" therapy. This therapy involves reactivating the virus from the latency with chemical compounds LRA (latency-reversing agents), which release transcriptional blocks. The cells awakened from latencydie from cytopathic or cytolytic effects while protecting healthy cells with antiretroviral drugs. This therapy, at the moment, is not fully effective as the inefficient reactivation of the virus from the latency state with the use of LRAs is only one of the factors responsible for the failure of the therapy in vivo. The use of LRAs affects only blocks of transcriptional latency, without affecting post-transcriptional blocks, therefore it is important to fully understand the mechanisms responsible for post-transcriptional latency. Characterization of these mechanisms should enable the release of post-transcriptional blocks and thus improve the effectiveness of "shock and kill" therapy.The aim of the master's thesis was to develop and characterize the a dual fluorescent reporter system to study the post-transcriptional export of HIV-1 RNA. Through a series of tests using inhibitors of Rev activity, it was proved that the developed model shows a specific Rev-dependent response. This model, due to its non-infectious nature, can be used in laboratories not equipped with BSL3-grade laboratory space, providing safe work with similar assay quality to that of full virus..The developed cell line is therefore a useful tool for the identification and characterization of new cellular factors representing potential therapeutic targets involved in HIV-1 post-transcriptional latency block, and in particular in a block for the export of viral RNA from the nucleus to the cytoplasm.