Overexpression and characterization of the Sll0034 protein as a carboxypeptidase involved in cell wall metabolism of cyanobacterium Synechocystis sp. PCC6803

Niewiele wiadomo na temat enzymów uczestniczących w metabolizmie ściany komórkowej sinic. DD-karboksypeptydazy uważane są za enzymy biorące udział w procesie wydłużania i sieciowania peptydoglikanu. Celem niniejszej pracy była ekspresja sinicowego białka Sll0034 z metką histydynową w komórkach Escherichia coli, oczyszczenie i wstępna charakterystyka enzymu. Wektory do transformacji E. coli wytworzono metodą bezszwowego klonowania DNA. Gen sll0034 z Synechocystis sp. PCC6803namnożono w reakcji PCR, wykorzystując polimerazę o wysokiej wierności replikacji. Plazmid pUC19 sklonowano z wektora pUC19_control wykorzystując tę samą polimerazę DNA. Sklonowany gen sll0034 został wprowadzony do wektora pUC19. Mieszaniną ligacyjną transformowano bakterie kompetentne metodą szoku cieplnego. Segregację transformantów prowadzono na podłożu selekcyjnym z dodatkiem ampicyliny. Wyizolowano plazmid, który wykorzystano do transformacji czterech różnych ekspresyjnych szczepów bakteryjnych: BL21, C43R, Rosetta PLYS oraz PRIL, a następnie stransformowane szczepy wysiano na szalki z antybiotykiem. Po dwukrotnym pasażu wybrano pojedyncze kolonie i nimi inokulowano płynne pożywki. Ekspresję białka Sll0034 indukowano dodając IPTG. Po nocnej inkubacji hodowle sonikowano, przeprowadzono denaturację chemiczno-cieplną, a następnie elektroforezę SDS-PAGE. Żel podzielono na połowy, zawierające te same próbki białka, a następnie jedną połowę wybarwiono błękitem Coomassie, a drugą wykorzystano do przeprowadzenia elektrotransferu oraz immunodetekcji przeciwciałami anty-6xHis. Założono po 30 ml hodowli szczepów Rosetta oraz BL21. Indukowano ekspresję dodając IPTG. Bakterie sonikowano, zwirowano, nadsącz naniesiono na uprzednio zrównoważone kolumny kobaltowe i eluowano białko. W celu sprawdzenia obecności białka Sll0034 w płynie elucyjnym przeprowadzono elektroforezę w warunkach denaturujących, a następnie żel wybarwiono błękitem Coomassie. Najwięcej spodziewanego białka w porównaniu do innych białek znajdujących się w eluacie znajdowało się w eluacie pochodzącym od szczepu BL21 co może wskazywać na jego najwydajniejszą ekspresję właśnie w tym szczepie. Stopień czystości uzyskanego preparatu uznano za niezadowalający, a procedurę oczyszczania za wymagającą dalszej optymalizacji.

There is little knowledge about the enzymes involved in cyanobacterial cell wall metabolism. DD-carboxypeptidases are considered to be involved in the process of peptidoglycan elongation and cross-linking. The aim of this study was the expression of cyanobacterial Sll0034 protein with histidine tag in Escherichia coli, purification and initial characterization of the enzyme. E. coli transformation vectors were generated by seamless DNA cloning. The sll0034 gene from Synechocystis sp. PCC6803 was amplified by PCR using a polymerase with high fidelity of replication. Plasmid pUC19 was cloned from the pUC19_control vector using the same DNA polymerase. Cloned sll0034 gene was entered into the pUC19 vector. The ligation mixture was transformed into competent bacteria by heat shock. Segregation of transformants was carried out on selective medium with the addition of ampicillin. Plasmid was isolated and used to transform four different expression strains: BL21, C43R, Rosetta PLYS and PRIL, and then transformed strains were plated on antibiotic dishes. After two passages, individual colonies were selected and inoculated liquid media. Expression of the Sll0034 protein was induced by the addition of IPTG. After overnight incubation, the cultures were sonicated and then after chemo-thermal denaturation, supernatant was used for SDS-PAGE electrophoresis. The gel was divided into halves containing the same protein samples, then one half was stained with Coomassie blue, and the other was used for electrotransfer and immunodetection with anti-6xHis antibody. 30 ml cultures of Rosetta and BL21 strains were established. Expression was induced by adding IPTG. Bacteria were sonicated, centrifuged and then the supernatant applied to pre-equilibrated cobalt columns for protein elution. To check the presence of the Sll0034 protein in the elution fluid, electrophoresis was performed under denaturing conditions and then gel was stained with Coomassie blue. The most expected protein compared to other proteins was found in the eluate derived from the BL21 strain which may indicate its most efficient expression in this strain. Purity level of the resulting preparation was considered unsatisfactory and the purification procedure requires further optimization.