Characteristics of the contribution of anti-apoptotic proteins from the Bcl-2 family to the survival and functions of neutrophils in the presence of the pathogen Porphyromonas gingivalis devoid of gingipains in vitro and in vivo

Porphyromonas gingivalis jest kluczowym patogenem przyczyniającym się do rozwoju przewlekłego zapalenia przyzębia. Indukuje on wzmożoną, wrodzoną odpowiedź immunologiczną gospodarza w postaci migracji leukocytów do miejsca infekcji, promując utrzymywanie przewlekłego stanu zapalnego. Celem niniejszej pracy była charakterystyka udziału białek anty-apoptotycznych z rodziny Bcl-2 na żywotność i funkcje neutrofili w obecności patogenu P. gingivalis pozbawionego gingipain. Badania przeprowadzono z wykorzystaniem dwóch modeli komórkowych tj. mysiego modelu neutrofili HoxB8 oraz pierwotnych ludzkich neutrofili wyizolowanych z krwi obwodowej zdrowych dawców. Stymulację neutrofili prowadzono z udziałem dwóch szczepów dzikich P. gingivalis W83 i ATCC33277, mutanta pozbawionego aktywności gingipain i lipopolisacharydu pochodzącego z P. gingivalis przy braku i w obecności inhibitorów gingipain KYT-1 i KYT-36 oraz polimyksyny B. Odpowiedź neutrofili na infekcję P. gingivalis analizowano uwzględniając ich żywotność, ekspresję anty-apoptotycznych białek z rodziny Bcl-2, produkcję reaktywnych form tlenu, aktywność elastazy neutrofilowej i sekrecję cytokin prozapalnych. Wykazano, że infekcja P. gingivalis promuje wydłużanie żywotności neutrofili regulowanej przez białka z rodziny Bcl-2. Badania przeprowadzone z udziałem pierwotnych ludzkich neutrofili potwierdziły istotną rolę gingipain w zaburzaniu funkcji neutrofili, zwłaszcza w kontekście indukcji produkcji reaktywnych form tlenu oraz hamowania aktywności elastazy neutrofilowej. Niemniej jednak, proteazy te nie wpływały na żywotność neutrofili i rozwój odpowiedzi zapalnej. Potwierdzono, że stymulacja mysich i ludzkich neutrofili lipopolisacharydem pochodzącym z P. gingivalis istotnie wydłuża ich żywotność, jednak w przeciwieństwie do modelu mysiego, nie bierze udziału w indukcji odpowiedzi zapalnej ludzkich neutrofili. Z kolei badania przeprowadzone z użyciem polimyksyny B wskazywały, że obniża ona odpowiedź prozapalną ludzkich neutrofili infekowanych bakteriami zwłaszcza w późnym stadium infekcji. Uzyskane wyniki dowiodły, że gingipainy pełnią istotną rolę w zaburzaniu funkcji i aktywności neutrofili, co w połączeniu z ich wydłużoną żywotnością regulowaną przez białka anty-apoptotyczne z rodziny Bcl-2 może przyczyniać się do rozwoju choroby zapalnej przyzębia.

Porphyromonas gingivalis is a keystone pathogen contributing to the development of periodontitis. It strongly induces an innate immune response by migration of leukocytes to the site of infection leading to chronic inflammation. This study aimed to characterize the contribution of anti-apoptotic proteins from the Bcl-2 family to the survival and function of neutrophils in the presence of the pathogen P. gingivalis devoid of gingipain activity. The studies used two cell models, the HoxB8 neutrophil system and primary human neutrophils isolated from the peripheral blood of healthy donors. Neutrophils were stimulated with two wild-type strains of P. gingivalis W83 and ATCC33277, a mutant devoid of gingipain activity and P. gingivalis-derived lipopolysaccharide in the absence and presence of the gingipain inhibitors KYT-1 and KYT-36 and polymyxin B. Neutrophil response to P. gingivalis infection was analyzed by measuring viability, expression of anti-apoptotic Bcl-2 family proteins, production of reactive oxygen species, neutrophil elastase activity and secretion of pro-inflammatory cytokines. Infection with P. gingivalis promotes prolonged neutrophils survival regulated by the anti-apoptotic Bcl-2 family proteins. Studies conducted on primary human PMNs have shown the significant role of gingipains in the disruption of their functions, especially in ROS production and NE activity. Nevertheless, gingipains did not affect PMNs viability and the development of a pro-inflammatory response. Stimulation of human PMNs with P. gingivalis-derived LPS Standard significantly prolonged their viability which was also observed in the HoxB8 neutrophil system. However, unlike the mouse model, it was not involved in the induction of the neutrophil inflammatory response. Intrestingly, studies conducted with polymyxin B indicated a significant reduction in the pro-inflammatory response of human PMNs infected with bacteria, especially in the late stage of infection. The obtained results proved that gingipains play a significant role in disrupting the function and activity of neutrophils, which, combined with their prolonged viability regulated by anti-apoptotic proteins from the Bcl-2 family, may contribute to the development of periodontitis.