The influence of the interaction between short isoform of human dopamine D2 receptor with G protein alpha i1 and alpha i2 subunits on the functionality of the dimer of this receptor with the bradykinin B2 receptor

Receptor dopaminowy 2 (D2R) jest przedstawicielem rodziny receptorów błonowych związanych z białkiem G (GPCR) i występuje w dwóch izoformach - krótkiej i długiej, różniących się między sobą obecnością 29 aminokwasów w trzeciej pętli wewnątrzkomórkowej receptora długiego. GPCR tworzą w błonie komórkowej dimery, a także wyższe kompleksy, które mogą modyfikować aktywację poszczególnych receptorów i wpływać na zmianę w ich sygnalizacji. Krótka izoforma tego receptora (D2RS) jest do tej pory mniej poznana, jednak podobnie jak w przypadku dłuższej izoformy (D2RL) może ona dimeryzować z receptorem bradykininy typu 2 (B2R). Biorąc pod uwagę różnice między dwoma izoformami D2R zakłada się, że konsekwencje takiej dimeryzacji mogą być różne.Celem niniejszej pracy było zbadanie oddziaływania D2RS z podjednostkami Gαi1 oraz Gαi2 trimerycznego białka G w błonie komórkowej oraz wpływu tego oddziaływania na funkcjonalność dimeru D2RS-B2R. Stworzono model komórkowy, wykazujący wzmożoną ekspresję D2RS w konfiguracji z różnymi białkami fuzyjnymi. Wyniki porównujące ekspresję D2R w komórkach linii HEK293 nietransfekowanych oraz transfekowanych potwierdziły zasadność użycia tego modelu. Poza tym, wyniki analizy saturacyjnej wykazały funkcjonalność receptorów D2RS. Badania potwierdziły, że D2RS kolokalizuje w błonie komórkowej zarówno z podjednostką Gαi1 jak i Gαi2. Wyniki FLIM-FRET udowodniły jednak, że białko Gαi1 jest chętniej sprzęgane przez D2RS niż białko Gαi2. Sprawdzono również, jak ten kompleks wpływa na sygnalizację komórkową w przypadku dimeryzacji z B2R. Uzyskane wyniki wskazują niejednoznacznie, że obecność podjednostki Gαi1 wzmacnia ogólną odpowiedź komórkową, związaną z wewnątrzkomórkowymi jonami Ca2+, a równoczesna aktywacja obu receptorów nie moduluje odpowiedzi aktywowanej przez agonistę B2R. W niniejszej pracy zasugerowano, że wiązanie antagonistów do poszczególnych receptorów dimeru w nieoczywisty sposób moduluje odpowiedź komórkową związaną z Ca2+, co należałoby poprzeć dalszymi badaniami. Podsumowując, wyniki niniejszej pracy pozwoliły zgłębić wiedzę o oddziaływaniu D2RS z białkiem G oraz receptorem B2R, co może przyczyniać się do lepszego zrozumienia zmian zachodzących w sygnalizacji obu receptorów po ich dimeryzacji i aktywacji ligandami. Ta wiedza jest pożądana z punktu widzenia szukania nowych terapii dla wielu chorób układu nerwowego i krwionośnego.

Dopamine receptor type 2 (D2R) belongs to the superfamily of G protein-coupled receptors (GPCRs) and exists in two isoforms - short (D2RS) and long (D2RL), which differ in the presence of 29 aminoacids in the third intracellular loop of the long receptor. GPCRs form dimers as well as oligomers in the cell membrane that can modify the activation of individual receptors and alter their signaling. D2RS is a less known izoform, however, just like D2RL, it can form dimers with the bradykinin type 2 receptor (B2R). Considering the differences between these two D2R isoforms it can be assumed that the consequences of such dimerization with B2R may differ. The aim of the study was to investigate the interaction of D2RS with G protein Gαi1 and Gαi2 subunits in the plasma membrane and its impact on the functionality of the D2RS-B2R dimer. Cells with enhanced expression of D2RS and co-expression with other fusion proteins were used in experiments. Experiments comparing the expression of D2R in the non-transfected and transfected HEK293 cells confirmed the importance of use transfected cells as cellular model for the study. The saturation analysis confirmed the functionality of the over-expressed D2RS and the D2RS-fusion proteins. The study demonstrated the co-localization of D2RS with both studied subunits of G protein: Gαi1 and Gαi2 in the cell membrane. However, the FLIM-FRET results showed that D2RS is more likely to couple Gαi1 than Gαi2. Additionally, obtained results indicate ambiguously that the presence of the Gαi1 subunit enhances the overall cellular response associated with intracellular Ca2+ release. Moreover, the simultaneous activation of both receptors does not modulate the response activated by the B2R agonist. It seems that the binding of antagonists to individual receptors within the dimer in a non-obvious way modulates the Ca2+ related cellular response. Additional studies are necessary to establish this assumption.In summary, the results obtained in this study increased the understanding of the interaction of D2RS with G proteins and B2R, what may contribute to a better understanding of changes in signaling of both receptors after dimerization and ligand activation. This knowledge is desirable from the point of view of finding new therapies for many diseases of the nervous and circulatory systems.