Evaluation of the effect of carp edema virus (CEV) on carp neutrophil activity

Akwakultura czyli hodowla organizmów wodnych (ryby, skorupiaki, algi) jest bardzo dynamicznie rozwijającą się gałęzią gospodarki rolno-spożywczej w wielu krajach na świecie. Rozwój akwakultury oraz intensyfikacja hodowli ryb prowadzą do zwiększenia zagęszczenia hodowanych osobników, co zwiększa poziom ich stresu oraz ułatwia patogenom ich atakowanie. Jednym z wirusów o dużym znaczeniu dla akwakultury jest wirus CEV (ang. carp edema virus ), który należy do rodziny pokswirusów i stanowi poważne zagrożenie dla hodowli karpi na całym świecie. Wirus ten prowadzi do choroby zwanej jako śpiączka karpi koi (KSD; ang. koi sleepy disease), powodującej poważne straty w hodowlach karpi. Szczególnie podatne na infekcje wirusem CEV są kolorowe odmiany karpia – karpie koi. Wirus CEV replikuje głównie w skrzelach oraz prowadzi do patologicznych zmian w tym narządzie. Skrzela u ryb odpowiadają za wymianę gazową, usuwanie metabolitów (amoniak), osmoregulację, utrzymanie właściwego pH oraz odpowiedź immunologiczną. Uszkodzenie tego narządu wywołuje u zakażonych ryb stres oraz zaburza homeostazę całego organizmu. Celem niniejszej pracy magisterskiej było zbadanie wpływu wirusa CEV na aktywność neutrofili karpia. W tym celu karpie koi zostały zakażone wirusem CEV poprzez kohabitację i w 6 dniu po zakażeniu od karpi zakażonych i karpi kontrolnych pobrano narządy do badań. Zbadano poziom wirusa CEV w skrzelach oraz oznaczono poziom kortyzolu i glukozy w surowicy. W zawiesinie komórek nerki głowowej oraz w leukocytach krwi obwodowej (PBL) zbadano % zawartość PMN (komórek polimofonuklearnych) oraz oznaczono poziom wolnych rodników tlenowych (ROS; ang. reactive oxygen species). W zawiesinie komórek nerki głowowej zbadano ekspresję genów związanych z dojrzewaniem neutrofili: mmp9, cxcr4, gcsfr(II), cxcl8, cxcr2, mpo oraz markerów związanych z neutrofilami typu N1: inos, il-12p35, il-1β i neutrofilami typu N2: arg2, il-10, ppar-γ, tgfβ. Badania wykazały, że zakażenie wirusem CEV prowadzi do zwiększonego stresu o czym świadczy podwyższony poziom kortyzolu i glukozy. Wirus ten prowadzi do zmniejszenia % zawartości PMN w zawiesinie nerki głowowej oraz zwiększenia % zawartości PMN w leukocytach krwi obwodowej. Nie zaobserwowano istotnych różnic w produkcji ROS pomiędzy grupą kontrolną a zakażoną. Analiza ekspresji genów związanych z dojrzewaniem wykazała podwyższony poziom ekspresji genu cxcl8 oraz obniżony poziom ekspresji mmp9, cxcr4, cxcr2. W przypadku markerów N1 wykazano obniżony poziom ekspresji genu il-1β, natomiast w przypadku markerów N2 wykazano podwyższony poziom ekspresji genów ppar-γ oraz tgfβ i obniżony poziom ekspresji arg2 i il-10. W niniejszej pracy wykazano, że wirus CEV wywołuje stres u zakażonych ryb oraz wykazuje działanie immunosupresyjne na wrodzoną odpowiedź immunologiczną.

Aquaculture, or the farming of aquatic organisms (fish, crustaceans, algae), is a rapidly growing branch of the agri-food industry in many countries around the world. The development of aquaculture and the intensification of fish farming lead to an increase in the density of farmed individuals, which increases their stress levels and makes it easier for pathogens to attack them. One virus of major importance for aquaculture is carp edema virus (CEV), which belongs to the poxvirus family and poses a serious threat to carp farming worldwide. This virus leads to a disease known as koi carp sleepy disease (KSD), causing serious losses to carp farms. Colored varieties of carp - koi carp - are particularly susceptible to CEV infection. The CEV virus replicates mainly in the gills and leads to pathological changes in this organ. The gills in fish are responsible for gas exchange, removal of metabolites (ammonia), osmoregulation, maintenance of the correct pH, and the immune response. Damage to this organ causes stress in infected fish and disrupts the homeostasis of the entire organism.The aim of this thesis was to study the effect of CEV virus on the neutrophil activity of carp. For this purpose, koi carp were infected with CEV by cohabitation, and on day 6 post-infection, organs were collected from infected carp and control carp for examination. CEV levels in the gills were examined, and cortisol and glucose levels in serum were determined. In cephalic kidney cell suspensions and peripheral blood leukocytes (PBL), the percentage of polymorphonuclear cells (PMN) was examined, and reactive oxygen species (ROS) levels were determined. In the cephalic kidney cell suspension, the expression of genes related to neutrophil maturation: mmp9, cxcr4, gcsfr(II), cxcl8, cxcr2, mpo and markers related to N1-type neutrophils: inos, il-12p35, il-1β and N2-type neutrophils: arg2, il-10, ppar-γ, tgfβ were examined. Studies have shown that CEV infection leads to increased stress, as evidenced by elevated levels of cortisol and glucose. The virus leads to a decrease in the percentage of PMN in cephalic kidney suspension and an increase in the percentage of PMN in peripheral blood leukocytes. No significant differences in ROS production were observed between the control and infected groups. Analysis of gene expression related to neutrophil maturation showed increased levels of cxcl8 gene expression and decreased levels of mmp9, cxcr4, and cxcr2 expression. N1 markers showed decreased expression levels of the il-1β gene, while N2 markers showed increased expression levels of the ppar-γ and tgfβ genes and decreased expression levels of arg2 and il-10. In the present study, CEV was shown to induce stress in infected fish and to have immunosuppressive effects on the innate immune response.