Regulation of microRNA-378a under hyperglycaemia. Significance for skeletal muscle regeneration in hyperglycaemic mice

W regenerację mięśni szkieletowych zaangażowanych jest wiele czynników stymulujących (miogenina, MHC), jak i hamujących (muskulina) różnicowanie komórek progenitorowych mięśni, mioblastów. Ostatnie badania wskazują również na zaangażowanie małego, niekodującego RNA, mikroRNA-378a (miR-378a), kodowanego w pierwszym intronie genu regulatora metabolizmu, czynnika PGC-1β, w regulację różnicowania mioblastów poprzez, między innymi wpływ na muskulinę.Co więcej, badania naszej i innych grup, wskazują na udział miR-378a w procesie angiogenezy nowotworowej, poprzez oddziaływanie na proangiogenne czynniki, takie jak VEGF, interleukina-8 i angiopoetyna-1. Oba te procesy, różnicowanie mioblastów i angiogeneza, kluczowe dla regeneracji mięśni, są upośledzone w cukrzycy charakteryzującej się zwiększonym poziomem glukozy we krwi (hiperglikemią).Celem niniejszej pracy było zbadanie regulacji miR-378a w warunkach zwiększonego stężenia glukozy podczas różnicowania mioblastów i w dojrzałych miotubach, a w szczególności znaczenia miR-378a dla regeneracji niedokrwionych mięśni szkieletowych myszy hiperglikemicznych.Jako model badawczy użyto linię mysich mioblastów C2C12 oraz myszy z niedoborem miR-378a (miR-378a-/-) i typu dzikiego (miR-378a+/+). W badaniach in vitro w pierwszej kolejności potwierdzono wzrost markerów różnicowania mięśni, miogeniny i miozyny, podczas różnicowania mioblastów, zarówno w warunkach kontrolnych, jak i zwiększonego stężenia glukozy. Istotny spadek poziomu represora różnicowania, muskuliny, zanotowano jednak tylko podczas różnicowania w warunkach kontrolnych. Istotnie, niezależnie od poziomu glukozy w hodowli, zaobserwowano wzrost miR-378a podczas różnicowania. Nie zanotowano jednak znaczących zmianw poziomie PGC-1β. Stymulacja wysokim stężeniem glukozy zwiększała jednak poziom miR-378a w mioblastach, ale nie w miotubach.W dalszej kolejności zbadano rolę miR-378a w regeneracji niedokrwionych mięśni szkieletowych hiperglikemicznych myszy miR-378a-/- i miR-378a+/+. Przy braku miR-378a wykazano nieznacznie silniejszy naciek zapalny w niedokrwionym mięśniu łydki w warunkach hiperglikemicznych. Istotnie, nie wykazano wpływu miR-378a na reperfuzję oraz na liczbę arterioli w niedokrwionych mięśniach łydki, ani u myszy kontrolnych, ani traktowanych streptozotocyną. Mimo braku zmian w ekspresji miogeniny, zaobserwowano, że w warunkach hiperglikemii liczba regenerujących fibryli jest niższa zarówno u myszy miR-378a-/-, jak i miR-378a+/+. Co istotne, zanotowano większą liczbę regenerujących fibryli przy braku miR-378a w tych warunkach. Ponadto, nie wykazano wpływu hiperglikemii na poziom ekspresji miR-378a w niedokrwionych mięśniach szkieletowych myszy. Odnotowano jednak spadek ekspresji PGC-1β w odpowiedzi na hiperglikemię indukowaną streptozotocyną u myszy obu genotypów. Podsumowując w pracy wykazano, że miR-378a jest regulowany przez zwiększone stężenie glukozy jedynie w mioblastach, ale nie na dalszych stadiach specyfikacji komórek mięśniowych, ani w regenerującym mięśniu. Ponadto, podważono udział miR-378a w regeneracji niedokrwionych mięśni szkieletowych u myszy hiperglikemicznych. Zanotowano jednak jego działanie antyzapalne.

Skeletal muscle regeneration recruits many factors, which can stimulate (myogenin, MHC) or inhibit (musculin) differentiation of skeletal muscle progenitor cells, known also as myoblasts. Recent studies point also the involvement of small, non-coding RNA, microRNA-378a (miR-378a), encoded within the gene of metabolic regulator, PGC-1β, in the regulation of myoblasts differentiation via musculin targeting. What is more,ours and other groups shown that miR-378a may be involved in tumor angiogenesis, via regulation of pro-angiogenic factors, such as VEGF, interleukin-8 or angiopoetin-1. Both processes, myoblasts differentiation and angiogenesis, important for muscle regeneration, are impaired in diabetes which is directly connected with elevated level of blood glucose (hyperglycaemia). The aim of this project was to investigate the role of miR-378a in hyperglycaemia during myoblast differentiation and in mature myotubes, especially significance of miR-378a during regeneration of ischemic skeletal muscle in hyperglycaemic mice.As a research model C2C12 murine myoblasts, mice with miR-378a deficiency (miR-378a-/-) and wild type mice (miR-378a+/+) were used. In in vitro studies, increased level of myogenic markers during myoblasts differentiation was shown, under both control and high glucose conditions. Significant decreased level of myogenic repressor, musculin, was shown only in case of myoblasts differentiation under standard glucose conditions. Substantially, independently of glucose concentration, increased level of miR-378a was observed during differentiation. Under high glucose conditions, no significant differences in the level of PGC-1β were detected. Moreover, high glucose concentration increased expression of miR-378a in myoblasts, but not in myotubes.In next step role of miR-378a in regeneration of ischemic skeletal muscle from hyperglycemic miR-378a-/- and miR-378a+/+ mice was investigated. In miR-378a absence, slightly enhanced leukocyte infiltration in ischemic calf muscle was observed under hyperglycaemia. Substantially, the influence of miR-378a on reperfusionand number of arterioles in ischemic calf muscle was not shown in both control and streptozotocin treated mice. Despite from no changes in myogenin expression level, it was observed, that under hyperglycaemic conditions number of regenerating muscle fibers was lower in both miR-378a-/- and miR-378a+/+ mice. Importantly, higher number of regenerating muscle fibres was recorded in the absence of miR-378a under these conditions. In addition, the influence of hyperglycaemia on the expression level of miR-378a was not detected. It was noticed, however, the expression of PGC-1β decreases in response to hyperglycaemia induced via streptozotocin treatment in both genotypes.To conclude, it was shown that miR-378a is regulated via higher glucose concentration only in myoblast, but neither at later stages of specification of skeletal muscle cells, nor in regenerating skeletal muscle. What is more, participation of miR-378a in regeneration of skeletal muscle in hyperglycaemic mice was undermined. However, the anti-inflammatory action of miR-378a was detected.