ADP-dependent glucokinases: cloning, expression, purification and crystallization of proteins phAK and celAK

ADPGK (ADP-zależna glukokinaza) jest białkiem biorącym udział w zmodyfikowanym szlaku Embdena-Meyerhofa-Parnasa, czyli powszechnie znanej glikolizie. Po raz pierwszy białko to zostało odkryte u hipertermofilnego archeonta − Pyrococcus furiosus, gdzie bierze udział w tym szlaku razem z ADP-zależnymi fosfofruktokinazami, jednakże wiadomo, że pełni rolę również u organizmów wielokomórkowych, w tym u człowieka. U eukariontów glikoliza rozpoczyna się przekształceniem glukozy do glukozo-6-fosforanu dzięki reakcji katalizowanej przez zależne od rodzaju tkanki izoformy enzymów zależnych od ATP zwane heksokinazami (1-4). Białka ADPGK nie są z nimi powiązane i są zaledwie odległym homologiem kinaz cukrowych z rodziny B w superrodzinie rybokinaz. Uważa się, że białko ADPGK jest istotne dla metabolizmu komórek, ponieważ pozwala im na przeprowadzenie glikolizy również w warunkach, w których poziom ATP w komórkach jest niski. Bardzo prawdopodobne jest, że właśnie z tego powodu białko to jest ekspresjonowane w szybkoproliferujących aktywowanych limfocytach T oraz w innych komórkach linii hematopoetycznej. Ponadto ADPGK wykazuje wysoką ekspresję w wielu tkankach nowotworowych wywodzących się właśnie z linii hematopoetycznej.Z uwagi na to, że jak dotąd nie przeprowadzono badań nad białkiem ADPGK pochodzącym z Caenorhabditis elegans (celAK), który jest organizmem modelowym w biologii, ani nie określono własności enzymatycznych ADPGK z Pyrococcus horikoshii (phAK), zaproponowano badania dotyczące charakterystyki obu białek. Badania obejmowały więc ekspresję, oczyszczanie oraz testy aktywności obu białek. Ponadto, z racji tego, że w literaturze znane są warunki krystalizacji ADPGK niektórych archeontów, podjęto próbę krystalizacji białka phAK, co miało na celu umożliwienie późniejszych prób ko-krystalizacji białka z inhibitorami oraz podjęcie prób nasączania otrzymanego kryształu inhibitorem. Testy aktywności białek pozwolą również na przeprowadzenie dalszych eksperymentów z potencjalnymi inhibitorami białka.

ADPGK (ADP-dependent glucokinase) is a protein which takes part in a modified Embden-Meyerhof-Parnas pathway commonly known as glycolysis. It was discovered in a hipertermophilic archae − Pyrococcus furiosus, where it contributes to this pathway along with ADP-dependent phosphofructokinases although it is known that it also has its role in multicellular organisms including human. In eukaryotes glycolysis begins with the conversion of glucose to glucose-6-phosphate thanks to the reaction catalysed by tissue-dependent isoforms of ATP-dependent enzymes called hexokinases (1-4). ADPGK proteins are in no way related to hexokinases and are just a long-distant homologue of family B of sugar kinases within the ribokinase superfamily. It is believed that ADPGK is crucial for cells because it allows them to carry out glycolysis even in a low ATP state. It is highly probable that this is the explanation why it is expressed in highly proliferative activated T-cell and other cells of the hematopoetic origin. Moreover ADPGK is overexpressed in many cancer tissues originating form hematopoetic lineage.Until now no one has carried out experiments on ADPGK from Caenorhabditis elegans (celAK), which is well-known as a model organism in biology, nor has anyone determined the Michaelis-Menten constant of ADPGK from Pyrococcus horikoshii (phAK). We propose experiments concerning the characterization of both proteins. The experiments included expression, purification and activity tests of both proteins. Furthermore, as crystallization conditions of some archeal ADPGKs are known, the phAK crystallization test were carried out to allow future co-crystallization with inhibitors or soaking obtained crystals with inhibitors. Activity tests will allow to carry out more experiments with prospective protein inhibitors.