Development and validation of LC/MS/MS method for determination of docosahexaenoic acid and eicosapentaenoic acid

Celem badań było opracowanie i walidacja metody jednoczesnego oznaczania DHA i EPA w osoczu ludzkim. Związki będące przedmiotem badań są przedstawicielami wielonienasyconych kwasów tłuszczowych szlaku ω-3. W oznaczeniach wykorzystano chromatografię cieczową sprzężoną z tandemową spektrometrią mas. Próbki przygotowano w oparciu o technikę strącenia odczynnikiem organicznym, używając etanolu jako czynnika strącającego. Porównano oczyszczanie próbki metodą strącenia z techniką wykorzystującą przepływ turbulentny cieczy (TurboFlow), pozwalającą na oczyszczenie próbki w systemie on-line (bez uprzednich czynności przygotowujących). Z powodu trudnego do usunięcia efektu przenoszenia (carry-over) w metodzie TurboFlow zaniechano przygotowania próbki tą techniką, na rzecz oczyszczania za pomocą strącania etanolem.Metodę poddano walidacji według wytycznych EMEA i FDA. Granica wykrywalności dla DHA wynosiła 0.5 μg/mL, natomiast dla EPA była równa 0.25 µg/mL. Granica oznaczalności tych związków była równa 1 ± 0.10 μg/mL. Liniową zależność odpowiedzi detektora od stężenia substancji nanoszonych na kolumnę chromatograficzną wyznaczono poprzez przygotowanie krzywej wzorcowej w zakresie stężeń 1-250 μg/mL. Współczynniki korelacji dla kwasu dokozaheksaenowego i eikozapentaenowego były wyższe od 0.995 i wynosiły odpowiednio 0.9993 oraz 0.9990. Parametry walidacji, takie jak dokładność i precyzja wyznaczono dzięki trzykrotnym pomiarom próbek o stężeniach 1, 3, 120 i 240 μg/mL. Miarą precyzji jest względne odchylenie standardowe wyrażone w procentach (RSD%), którego wartość dla pierwszego punktu na krzywej nie przekraczała 20%, a dla pozostałych punktów była niższa od 15%. Odzysk, będący miarą dokładności metody mieścił się w granicach 80-120% dla pierwszego punktu na krzywej oraz 85-115% dla kolejnych punktów. Metodę „post extraction addition” zastosowano do wyznaczenia odzysku analitów. Wartości odzysku przekraczające 100% świadczą o obecności w osoczu ludzkim związków endogennych o tej samej masie cząsteczkowej co badane związki. Efekt matrycy zbadano poprzez oznaczanie DHA i EPA w osoczu ludzkim pochodzącym od 5 różnych ochotników. Dokładność i precyzja uzyskanych wyników porównana z wynikami odczytanymi z krzywej wzorcowej mieściła się w przedziale wartości akceptowalnych dla metod bioanalitycznych. W badaniach oceniono również stabilność krótkoterminową, stabilność przechowywania próbek w autosamplerze, stabilność 3 cykli rozmrażania i zamrażania próbki oraz stabilność długoterminową. Stosunek różnicy stężeń próbki standardowej odczytanej z krzywej wzorcowej i próbki poddanej badaniu stabilności, do stężenia próbki standardowej odczytanej z krzywej wzorcowej mieścił się w zakresie ± 15%.

The aim of this research was to develop and validate a method for simultaneous determination of DHA and EPA in human plasma. These compounds are members of polyunsaturated fatty acids of ω-3 pathway. The assay employs liquid chromatography with tandem mass spectrometry. Samples were prepared on the base of the precipitation technique using ethanol as a precipitant. Sample purification by precipitation was compared with the turbulent flow technique (TurboFlow), allowing the purification of the sample in the on-line (without earlier manipulation). Because of the carry-over effect in TurboFlow method, which was difficult to remove, it was abandoned to prepare the sample by the technique of turbulent flow of eluent for purification using precipitation.The method was validated by the EMEA and FDA guidelines. The limit of detection for DHA and EPA was 0.5 mg/mL, while the limit of quantification of these compounds was equal to 1 ± 0.10 µg/mL. The linear dependence of the detector response to the concentration applied on the chromatographic column was determined by preparing a calibration curve in the concentration range of 1 - 250 mg/mL. The correlation coefficients for DHA and EPA exceeded the 0.995 and amounted to 0.9993 and 0.9990, respectively. Validation parameters such as accuracy and precision were determined by three-time measurements of samples with concentrations of 1, 3, 120 and 240 μg/mL. The measure of precision of the relative standard deviation is expressed as a percentage (% RSD ), the values of the first point on the curve does not exceed 20%, and for the remaining points were lower than 15%. The recovery, which is a measure of accuracy, ranged from 80-120% for the first point on the curve, and 85-115% for the subsequent ones. The method of "post extraction addition" was used to calculate the recovery of the analytes. Calculated values of this parameter exceeded 100%, which indicates the presence of endogenous compounds with the same molecular weight as DHA and EPA in human serum. The matrix effect was examined by determining the concentration of DHA and EPA in human serum derived from five different volunteers. Accuracy and precision of the obtained results were compared with the results read from the calibration curve and were in the range of acceptable values for the above parameters. The study also assessed short-term stability, the stability in the autosampler batch, the stability of freezing and defreezing and long-term stability. The ratio of the difference of the sample concentrations from the standard calibration curve and sample stability test to the concentration of the standard of the calibration curve was in the range of ± 15%.